| 研究課題/領域番号 |
21K06869
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分49010:病態医化学関連
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| 研究機関 | 九州大学 |
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研究代表者 |
土本 大介 九州大学, 生体防御医学研究所, 助教 (70363348)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)
2023年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2022年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2021年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
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| キーワード | イノシン三リン酸 / 発達性およびてんかん性脳症 / 静止膜電位脱分極 / EIEE35 / ITPA / てんかん / 脱分極 / 膜電位 / イノシン |
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| 研究開始時の研究の概要 |
イノシン三リン酸（ITP）は非正規プリンヌクレオチドである。ITP分解酵素（ITPA）欠損は重篤な乳幼児てんかん性脳症と拡張型心筋症を引き起こす。我々はITPA欠損マウスモデルの作成に成功し、心筋筋繊維構造の乱れや脳神経細胞の静止膜電位上昇を伴うてんかん発作などの重要な知見を明らかにした。本研究では、①「ITPA欠損症」の分子病態のさらなる解明を行い、②ITP産生経路の解明と並行してITP産生阻害作用を持つ化合物を探索して「ITPA欠損症」治療法を開発する。さらに、③日本人に多いITPA遺伝子の94C>A(P32T)マイナーアレルが脳神経系や心筋へ与える影響について解析する。
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| 研究実績の概要 |
2022年度はITPA欠損マウスNeuro2a培養細胞を用い、オートファゴソーム、小胞体、ゴルジ体、の染色パターンをコントロール細胞と比較した。また同細胞の全抽出液を用いた二次元電気泳動後のゲル銀染色パターンをコントロール細胞と比較した。いずれも差を認めなかった。
ITPA欠損マウスNeuro2a細胞にヒトITPA発現ベクターもしくはコントロールベクターを導入したクローンを各々３クローン以上樹立した。これらの細胞を用いて膜電位評価を行ったところ、ITPA欠損マウス脳スライス神経細胞で観察された結果と同様の静止膜電位脱分極が観察された。このため今後はこれらの細胞を用いてITPA欠損が引き起こす影響を解析することとした。その比較をRNAseqで行うため、これらの細胞よりtotal RNAを調製した。
コントロール細胞と比較してITPA欠損マウスNeuro2a細胞特異的に細胞増殖抑制と細胞死誘導がかかる培養条件を検討し見出した。この培養条件を用いて、イノシン三リン酸産生経路を明らかにするためマウス遺伝子に対するshRNAのレンチウイルスベクターライブラリー感染実験を行い、細胞増殖抑制／細胞死をレスキューするshRNAのスクリーニングを開始した。最終的に残存細胞ゲノムDNAを解析して目的shRNAの標的遺伝子を確認する。
哺乳動物におけるイノシン三リン酸蓄積防止におけるNUDT16の寄与を確認するために、以前に作成したNudt16 欠損マウス(Nudt16 KO)と脳神経系特異的ITPA欠損マウスItpa-flox/Nes-Creマウスとの交配を開始し、Itpa-flox(F/+)/Nes-Cre(Tg)/Nudt16(-/-)マウスを得た。最終的にはItpa-flox(F/F)/Nes-Cre(Tg)/Nudt16(-/-)を作成、解析予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
2022年度は概ね順調に進展した。ただし、2021年度に所属研究室の予想していなかった業務に追われたことで生じた研究課題進行の遅れがまだ取り戻せていない状況である。2022年度に続いて2023年度も研究課題に集中できる予定なので遅れを取り戻したい。
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| 今後の研究の推進方策 |
ITPA欠損培養細胞を用いた研究については、現在進行中のshRNAライブラリーを用いたITPA欠損細胞をレスキューできるshRNAの探索を引き続き行う。細胞内でのITP生成に関わる酵素遺伝子を標的としたshRNAが見つかることを期待している。その酵素に対する阻害剤はITPA欠損症治療薬として期待できる。
ITPA欠損培養細胞由来RNAを用いたRNAseqも行う予定である。ITP蓄積が引き起こす静止膜電位脱分極などに関わる遺伝子の発見を期待する。その遺伝子は他のてんかん性脳症の発症に関わる可能性もある。RNAseq以外にもITPA欠損細胞を用いた静止膜電位脱分極の分子機構解明を目指す実験を予定している。
Itpa-flox(F/F)/Nes-Cre(Tg)/Nudt16(-/-)マウスの作成と解析を進める。Itpa-flox(F/F)/Nes-Cre(Tg)マウスと比較して生後３週間程度の寿命が更に短くなり、RNA中にイノシンが蓄積することが期待される。
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