| 研究課題/領域番号 |
21K06945
|
|---|
| 研究種目 |
基盤研究(C)
|
| 配分区分 | 基金 |
|---|
| 応募区分 | 一般 |
|---|
| 審査区分 |
小区分49030:実験病理学関連
|
|---|
| 研究機関 | 東京医科歯科大学 |
|---|
研究代表者 |
倉田 盛人 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 講師 (40451926)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
|
| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
|
| 配分額 *注記 |
4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)
2023年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
2022年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
2021年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
|
|---|
| キーワード | 薬剤耐性 / CRISPR screening / 細胞間相互作用 |
|---|
| 研究開始時の研究の概要 |
癌細胞は支持細胞と微小環境を形成し、微小環境における細胞間相互作用が抗癌剤の治療抵抗性を誘導することが知られている。そこで、本研究では癌の治療抵抗性を克服する為に、細胞間相互作用を対象とした治療ターゲット分子を網羅的に検索することとする。具体的には、CRISPR libraryを用いて支持細胞へランダムな変異を誘導し、薬剤投与下での腫瘍細胞との共培養により、腫瘍細胞に薬剤耐性を誘導できる疑似微小環境を作成する。疑似微小環境内にて薬剤耐性誘導が可能である支持細胞のみを分離・責任ガイドRNAを同定し、治療ターゲットとなる候補遺伝子の同定や新規薬剤耐性メカニズムを解明する。
|
| 研究実績の概要 |
腫瘍微小環境において、がん幹細胞と間質支持細胞の相互作用により薬剤耐性が誘導されることが知られている。我々は新たな実験系である「間接的CRISPR screening」を確立した。
昨年までに、間接的CRISPR screeningにて得られた各候補遺伝子の変異支持細胞を作成し、それらと共培養した白血病細胞株や膵癌細胞株において抗癌剤曝露下で有意に生存・増殖することが確認された。
C9orf89、MAGI2、MLPH、RHBDD2の4種 のHEK293T 欠損細胞クローンに関して、RNA-sequencingを行った。GSEA解析では、いずれの欠損細胞においてもサイトカイン活性が最も活性化されており、その中でも特にCXCL12の発現が共通して最も上昇していた。定量的PCRおよびELISAの結果よりRHBDD2欠損でのCXCL12発現・分泌上昇が確認された。また、CXCL12中和抗体を用いた共培養・Ara-C曝露実験を行ったところ、HEK293T/UE7T-9 RHBDD2欠損細胞株によるAra-C曝露下でのU937のアポトーシスの抑制が、中和抗体によりキャンセルされた。
間質細胞の分泌するCXCL12による腫瘍細胞の薬剤耐性獲得機構として、PI3K-Akt-mTOR経路の活性化が知られている。HEK293T/UE7T-9 RHBDD2欠損細胞とU937を共培養し、Aktのリン酸化を評価した。U937におけるAktのリン酸化は、コントロール共培養群あるいはU937単独培養群と比較して、HEK293T RHBDD2欠損細胞と共培養した際に有意に亢進していた。
また、膵癌臨床検体の検討では、間質細胞でのRHBDD2低発現が独立予後不良因子であり、またRHBDD2とCXCX12発現に逆相関することが確認された。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ノックアウトされた支持細胞においてどのようなシグナルが働いているかなどRNAシークエンスなどを用いて機序の解明を行い、生物学的な確認実験が完了した。
また、予定通りに臨床検体を用いた確認研究も行えた。
|
| 今後の研究の推進方策 |
本CRISPRスクリーニングでは発現の低下による薬剤耐性が誘導される分子が同定される。しかしながら、治療ということを視野に入れた場合には、候補遺伝子の過剰発現が薬剤感受性に寄与することが期待される。耐性メカニズムの解明と共に、対象候補分子のアゴニストとして働く既存の化合物を同定する。また、その発現を上流で発現を負に制御する分子が同定される候補遺伝子では、その阻害剤が治療候補の分子となりうることを検証する。
|
