| 研究課題/領域番号 |
21K07005
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分49050:細菌学関連
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| 研究機関 | 高知大学 |
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研究代表者 |
村松 久司 高知大学, 教育研究部総合科学系生命環境医学部門, 准教授 (90437343)
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| 研究分担者 |
柏木 丈拡 高知大学, 教育研究部総合科学系生命環境医学部門, 教授 (60363256)
若松 泰介 高知大学, 教育研究部総合科学系生命環境医学部門, 准教授 (60597938)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2023年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2022年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2021年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
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| キーワード | エルゴチオネイン |
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| 研究開始時の研究の概要 |
類鼻疽は予防に有効なワクチンや薬剤がなく、初期の治療に失敗すると治癒が困難になる人獣共通感染症である。これまでに、類鼻疽菌がエルゴチオネインを合成すること、エルゴチオネインが類鼻疽菌の感染力を増強することが報告されている。また、類鼻疽菌のゲノム情報から類鼻疽菌はエルゴチオネイン合成系だけでなく、分解系も持つことが強く示唆される。本研究では、類鼻疽菌と同属のバークホルデリア属細菌を用いて、細胞内に生産されたエルゴチオネインがなぜ分解されないのか、その仕組みの解明を目指す。
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| 研究実績の概要 |
Burkholderia sp. HME13由来ErtDをHisタグ融合タンパク質として取得し、諸性質を調べた。EDTAを含む緩衝液で透析したErtDはヒダントイン-5-プロピオン酸アミドヒドロラーゼ活性を示さなかった。EDTAで透析したErtDはMn2+、Co2+の添加で大幅に活性を回復し、Mg2+、Fe2+、Ni2+、Zn2+の添加でもわずかに活性を回復させた。これらの結果から、ErtDは金属イオン依存性酵素であることがわかった。Mn2+を含むErtDの安定性、反応に最適な温度とpH、キネティックパラメータを明らかにした。エルゴチオネイン培地で培養したBurkholderia sp. HME13の粗酵素液中にはErtDの活性が検出されるが、LB培地で培養した本菌株の粗酵素液中からはErtDの活性が検出されなかった。また、エルゴチオネイン培地で培養したBurkholderia sp. HME13のertD遺伝子発現量はLB培地で培養した本菌株よりも3.3倍高いことがリアルタイムPCRで明らかになったことから、Burkholderia sp. HME13のErtDはエルゴチオネイン資化に関わることが強く示唆された。
Burkholderia sp. HME13のエルゴチオネイン資化に関与すると推定されるErtCのHisタグ融合タンパク質を取得し、本酵素が3-(5-オキソ-2-チオキソイミダゾリジン-4-イル)プロピオン酸デスルフヒドラーゼ活性を持つことを発見し、すでに国際誌で報告済みである。しかし、ErtCの酵素学的諸性質は不明であるため、Hisタグを付加しないNative ErtCを生産する大腸菌株を構築し、本酵素を均一に精製した。また、エルゴチオネイン資化に関与すると推定されるNative ErtEの精製法も確立できたので、現在、これらの酵素の諸性質の解明を試みている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
今年度はErtDの酵素学的諸性質について国内学会で発表するとともに、本研究成果を原著論文にまとめて国際誌で発表した。一部の実験でわずかな遅れが生じているものの、研究全体としてはおおむね予定通りに進んでいる。
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| 今後の研究の推進方策 |
Burkholderia sp. HME13由来ErtCの安定性や反応の最適条件を明らかにする。本酵素は当研究室で発見した新奇酵素であり、本研究より新しい知見の取得が期待される。また、Native ErtEの諸性質を明らかにし、既知のＮ-カルバミルアミノ酸アミドヒドロラーゼの諸性質と比較する。また、培地中のエルゴチオネインがこれらの酵素遺伝子の発現レベルに及ぼす影響をリアルタイムPCRで調べる。
エルゴチオネイン資化酵素群発現のインデューサーはエルゴチオネインではなく、エルゴチオネインの代謝中間体であるチオウロカニン酸であると考えている。チオウロカニン酸を含む培地で培養したBurkholderia sp. HME13から調製した粗酵素液中のエルゴチオネイン資化酵素活性を測定し、仮説の検証を試みる。
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