| 研究課題/領域番号 |
21K07029
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分49050:細菌学関連
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| 研究機関 | 大阪公立大学 (2022)
大阪市立大学 (2021) |
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研究代表者 |
藤田 憲一 大阪公立大学, 大学院理学研究科, 准教授 (10285281)
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| 研究分担者 |
臼杵 克之助 大阪公立大学, 大学院理学研究科, 准教授 (30244651)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)
2023年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2022年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2021年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
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| キーワード | 抗真菌 / 薬剤耐性 / 多剤耐性薬剤排出ポンプ / 小胞体ストレス応答 / 真菌 / 薬剤排出ポンプ / 小胞体 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
病原性真菌の多剤耐性に関わる薬剤排出ポンプの過剰発現機構の解明は、薬剤耐性を抑制する薬の開発にとって重要である。真菌の薬剤排出ポンプ遺伝子の発現に関わる2つの転写因子のうち、真菌に特異な転写因子Pdr3タンパク質には薬剤と相互作用する部位が存在しないため、転写誘導メカニズムの詳細は未だ不明である。本研究では、小胞体ストレスに起因するシグナル伝達の遮断によってPdr3が転写誘導されるという想定の下に、真菌の薬剤排出に関わる転写因子の新たな活性化機構を提案することを目的とする。
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| 研究実績の概要 |
真菌の薬剤耐性を抑制する薬の開発のためには、まず、真菌の薬剤耐性機構を解明することが重要である。本研究は、小胞体ストレスに着目することで、小胞体の異常と薬剤排出ポンプPDR5高発現による薬剤耐性化の関係について検証することを目的とした。薬剤耐性を亢進させるモデル抗真菌薬のドデカノールを用いて、出芽酵母における小胞体ストレスと薬剤排出ポンプPDR5高発現の関係について検証した。
まず、ドデカノールが活性酸素種(ROS)を産生させるかを検討した。その結果、ドデカノール処理によってROSが産生され、抗酸化剤ビタミンEによりその産生量は抑制されることが分かった。次に、GFPにより蛍光標識した小胞体ストレス応答タンパク質Ire1p発現株を用いて、Ire1pの小胞体膜への集合を評価し、ドデカノール処理時に小胞体ストレスが起こるのかを検証した。その結果、ドデカノール処理によってIre1pが小胞体膜へ集合し、小胞体ストレス応答が起こることが分かった。また、ドデカノールとビタミンE を同時処理することでIre1pの集合が抑制された。また、IRE1欠損株に対するドデカノールの抗真菌作用を検証した結果、親株に比べてIRE1欠損株はドデカノール処理によって低下する生菌数の回復が早く起こった。最後に、IRE1欠損株のPDR5発現量をリアルタイムPCR法にて、薬剤排出活性をローダミン6Gを用いる蛍光法にて調べた。その結果、IRE1欠損株ではPDR5の転写量が増加し、加えてポンプの排出活性も高いことがわかった。
以上より、出芽酵母において、ドデカノールを処理することでROSが産生され、それが原因となり小胞体ストレスが誘導され、応答反応が起こることが示唆された。また、IRE1欠損株は薬剤排出活性が増大することで親株と比べてドデカノール処理による生育抑制から早く復帰することが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
真菌の薬剤耐性機構の一つである薬剤排出ポンプの亢進が小胞体ストレス応答の抑制に依存するポンプ遺伝子の転写調節に関与することがほぼ検証できたと判断した。ただし、コロナ渦による制限により、研究の進捗は予想よりやや遅れている。小胞体ストレス応答に起因するユビキチン-プロテアソーム系の抑制も関与するのかは今後の検討課題である。
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| 今後の研究の推進方策 |
小胞体ストレス応答が薬剤耐性の抑制に関わっていることが今回判明した。その応答は細胞内で産生される活性酸素種が関与することが明らかとなった。今後は、薬剤によって起こるストレスが活性酸素種産生を誘導する機構をさらに解析するとともに、小胞体ストレス応答に起因するユビキチン-プロテアソーム系の排出ポンプの分解抑制に依存するのかについても解析していきたいと考えている。
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