広範囲の抗ウイルス活性を示す宿主因子MARCH8の分子抑制機構の解明

• 研究課題/領域番号: 21K07060
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 基金
• 応募区分: 一般
• 審査区分: 小区分49060:ウイルス学関連
• 研究機関: 国立感染症研究所
• 研究代表者: 徳永 研三 国立感染症研究所, 感染病理部, 主任研究官 (50342895)
• 研究期間 (年度): 2021-04-01 – 2025-03-31
• 研究課題ステータス: 交付 (2023年度)
• 配分額: 4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円); 2023年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円); 2022年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円); 2021年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
• キーワード: MARCH8 / 抗ウイルス活性 / 動物種 / キメラタンパク質 / RNF152 / ウイルスエンベロープ糖蛋白質 / シュードウイルス / 宿主因子 / エンベロープウイルス / 補因子

研究開始時の研究の概要

我々が世界に先駆けて報告したヒトタンパク質MARCH8が、エイズウイルス、狂犬病ウイルス、新型コロナウイルス等、様々なウイルス感染を抑えることをこれまで明らかにしてきた。本研究では、MARCH8が種々のウイルス感染を抑制する分子メカニズムについて詳細に検討する。以前の研究でMARCH8の機能を補助する宿主因子の存在が示唆されたが、その因子を見つけるためにMARCH8と結合するタンパク質を選出する。更にそのMARCH8結合タンパク質がウイルス感染抑制において実際にMARCH8の補助因子として機能することを確認する。この研究を通してMARCH8がウイルス感染予防・治療に応用可能かどうかを検討する。

研究実績の概要

抗ウイルス宿主因子MARCH8の新たな研究成果に関連して、原著論文の執筆を進めた。この過程において、昨年度までに得られたデータに加え、種々の追加実験を展開した。まず、水疱性口内炎ウイルスGタンパク質（VSV-G）に対するMARCH8の抑制効果について、各動物種（サル、マウス、ウシ）由来の野生型および2種類の変異体（RING-CH変異体、YxxL変異体）を用いて検証した。実験では、HIV-1-Env欠損型ルシフェラーゼレポーターウイルスDNAとVSV-G発現ベクターとともに各MARCH8をヒト胎児腎細胞株293Tに導入し、産生されたウイルスの感染性を評価した。その結果、各動物種型もヒト型と同様、野生型MARCH8とそのYxxL変異体はVSV-Gに対する抑制活性を示し、RING-CH変異体は抑制活性を失っていた。これにより、MARCH8の抗VSV-G活性とその機能領域が動物種間で保存されていることが示唆された。さらに、抗ウイルス活性を持たないMARCH3との間で組換えたMARCH8/3キメラを用いた感染実験により、MARCH8の抗HIV-1-Env/VSV-G活性にはN末とC末の細胞質領域に加えて、N末膜貫通領域が重要であることが分かった。これらキメラタンパク質の細胞内局在性を、MARCH8、細胞骨格、および核の3重染色で検討した結果、N末/C末の細胞質領域とN末膜貫通領域がMARCH8由来である場合に限り、野生型MARCH8と同様の細胞膜局在を示した。この細胞膜局在の有無は、抗ウイルス活性の有無と一致していた。また本研究と並行してMARCH8に類似する膜貫通型ユビキチンリガーゼRNF152の細胞生物学的解析を行った。RNF152がメラニン合成に重要な酵素チロシナーゼをユビキチン化してリソゾーム分解することにより、メラニン合成を負に制御することを明らかにした。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

コロナ禍の入国制限のため予定より大幅に遅れて2022年5月半ばに来日した中国人留学生の孔徳川氏（熊本大学大学院博士課程入学）は、前職が上海CDCの疫学部門スタッフで、ラボのウェット実験は未経験であったため、昨年度も彼に対するウイルス学・免疫学・分子生物学・細胞生物学に関する講義および各実験手法の指導に多大な時間を費やした。そして彼にとって本来4年間ある医学系大学院生活がすでに13か月半のロス、つまり学位取得に必要な論文採択期限まで2年半を切った状況でスタートしていたため、彼の来日以前から進めていたMARCH8研究の延長線上でかつ論文化し易い研究テーマを展開していく必要があった。したがって、当初予定していた本年度の研究計画におけるプライオリティの変更を余儀なくされ、MARCH8の抗ウイルス活性における宿主コファクターの同定に関する研究は、期間延長の2024年度に持ち越しとなった。ただその間に長崎国際大の藤田英明先生との共同研究で、MARCH8様の膜貫通型ユビキチンリガーゼRNF152に関する細胞生物学的な研究の成果をMembranes誌に報告した。さらに、フランス・カナダ・ポルトガルの国際共同チームに孔徳川氏とともに加わりSARS-CoV-2のワクチン効果に関する研究成果をScience Advancesに報告、また感染研の部内チーム研究としてSARS-CoV-2における粘膜免疫の重要性に関する研究をPNASに報告し、さらに東大医科研の佐藤佳先生との共同研究でコウモリコロナウイルスのトロピズムに関する研究結果をJ. Virolに報告した。

今後の研究の推進方策

期間延長の最終年度（2024年度）は、MARCH8の宿主コファクターの同定に取り組む。まず他の動物種由来のMARCH8で報告されている宿主因子についてピンポイントで解析する。すなわち、MARCH8と当該関連因子を共発現させて免疫沈降を行い、分子間相互作用を確認する。ノックダウン/ノックアウト実験によるMARCH8の抗ウイルス機能強化の有無に関する解析により、MARCH8のコファクター要求性を検証する。また両者の結合領域の同定を行う。さらに網羅的解析として、東京大学先端科学技術研究センターの川村猛先生との共同研究により、MARCH8結合タンパク質のプロテオミクスを行う。その実験にあたりMARCH8発現細胞とコントロール細胞の大量調整を行い、抗MARCH8抗体による免疫沈降サンプルを解析に用いる。検出スコアの上位に位置する宿主タンパク質のDNAクローニングを行ったのち、上記と同様の実験を実施する。

研究成果

• [国際共同研究] Takuya Tada/New York University(米国)
• [雑誌論文] Membrane-Associated Ubiquitin Ligase RING Finger Protein 152 Orchestrates Melanogenesis via Tyrosinase Ubiquitination (2024)
  • 著者名/発表者名: Ueda R, Hashimoto R, Fujii Y, Menezes JCJMDS, Takahashi H, Takeda H, Sawasaki T, Motokawa T, Tokunaga K (Co-corresponding author), Fujita H.
  • 雑誌名: Membranes 巻: 14 号: 2 ページ: 43-43
  • DOI: 10.3390/membranes14020043
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Repetitive mRNA vaccination is required to improve the quality of broad-spectrum anti?SARS-CoV-2 antibodies in the absence of CXCL13 (2023)
  • 著者名/発表者名: Azarias Da Silva M, Nioche P, Soudaramourty C, Bull-Maurer A, Tiouajni M, Kong D, Zghidi-Abouzid O, Picard M, Mendes-Frias A, Santa-Cruz A, Carvalho A, Capela C, Pedrosa J, Castro AG, Loubet P, Sotto A, Muller L, Lefrant JY, Roger C, …, Tokunaga K, Silvestre R, Corbeau P, Mammano F, Estaquier J.
  • 雑誌名: Science Advances 巻: 9 号: 31
  • DOI: 10.1126/sciadv.adg2122
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Determination of the factors responsible for the tropism of SARS-CoV-2-related bat coronaviruses to <i>Rhinolophus</i> bat ACE2 (2023)
  • 著者名/発表者名: Fujita Shigeru、Kosugi Yusuke、Kimura Izumi、Tokunaga Kenzo、Ito Jumpei、Sato Kei、 et al.
  • 雑誌名: Journal of Virology 巻: 97 号: 10
  • DOI: 10.1128/jvi.00990-23
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Infectious virus shedding duration reflects secretory IgA antibody response latency after SARS-CoV-2 infection (2023)
  • 著者名/発表者名: Miyamoto S, Nishiyama T et al.
  • 雑誌名: Proceedings of the National Academy of Sciences 巻: 120 号: 52 ページ: 1-10
  • DOI: 10.1073/pnas.2314808120
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Characterization of the Immune Resistance of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 Mu Variant and the Robust Immunity Induced by Mu Infection (2022)
  • 著者名/発表者名: Uriu Keiya et al.
  • 雑誌名: The Journal of Infectious Diseases 巻: 00 号: 7 ページ: 00-00
  • DOI: 10.1093/infdis/jiac053
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Construction and evaluation of a self-replicative RNA vaccine against SARS-CoV-2 using yellow fever virus replicon (2022)
  • 著者名/発表者名: Nakamura A, Kotaki T, Nagai Y, Takazawa S, Tokunaga K, Kameoka M.
  • 雑誌名: PLoS One 巻: 17 号: 10 ページ: e0274829-e0274829
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0274829
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] The SARS-CoV-2 Lambda variant exhibits enhanced infectivity and immune resistance (2022)
  • 著者名/発表者名: Kimura Izumi、Kosugi Yusuke、Wu Jiaqi、other 17 authors、Saito Akatsuki、Nakagawa So、Sato Kei
  • 雑誌名: Cell Reports 巻: 38 号: 2 ページ: 110218-110218
  • DOI: 10.1016/j.celrep.2021.110218
  • NAID: 120007183813
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] MARCH8 Targets Cytoplasmic Lysine Residues of Various Viral Envelope Glycoproteins (2022)
  • 著者名/発表者名: Zhang Yanzhao、Ozono Seiya、Tada Takuya、Tobiume Minoru、Kameoka Masanori、Kishigami Satoshi、Fujita Hideaki、Tokunaga Kenzo
  • 雑誌名: Microbiology Spectrum 巻: 10 号: 1
  • DOI: 10.1128/spectrum.00618-21
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Attenuated fusogenicity and pathogenicity of SARS-CoV-2 Omicron variant (2022)
  • 著者名/発表者名: Suzuki Rigel、Yamasoba Daichi、Kimura Izumi、Wang Lei他
  • 雑誌名: Nature 巻: 603 号: 7902 ページ: 700-705
  • DOI: 10.1038/s41586-022-04462-1
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Altered TMPRSS2 usage by SARS-CoV-2 Omicron impacts infectivity and fusogenicity (2022)
  • 著者名/発表者名: Meng Bo、Abdullahi Adam、Ferreira Isabella A. T. M.、Goonawardane Niluka、Saito Akatsuki、Kimura Izumi、Yamasoba Daichi、Other 48 authors、Sato Kei、Gupta Ravindra K.
  • 雑誌名: Nature 巻: 603 号: 7902 ページ: 706-714
  • DOI: 10.1038/s41586-022-04474-x
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Vaccination-infection interval determines cross-neutralization potency to SARS-CoV-2 Omicron after breakthrough infection by other variants (2022)
  • 著者名/発表者名: Miyamoto S, Arashiro T, Adachi Y, Moriyama S, Kinoshita H, Fukushi S, Takahashi Y, Suzuki T et al.
  • 雑誌名: Med 巻: 3 号: 4 ページ: 249-261
  • DOI: 10.1016/j.medj.2022.02.006
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] COVID-19とACE2 (2022)
  • 著者名/発表者名: 多田卓哉、徳永研三
  • 雑誌名: 腎と透析 巻: 92 ページ: 62-68
  • 国際共著
• [雑誌論文] MARCH8: the tie that binds to viruses (2021)
  • 著者名/発表者名: Tada T, Zhang Y, Fujita H, Tokunaga K.
  • 雑誌名: The FEBS Journal 巻: - 号: 13 ページ: 3642-3654
  • DOI: 10.1111/febs.16017
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Aromatic Side Chain at Position 412 of SERINC5 Exerts Restriction Activity toward HIV-1 and Other Retroviruses (2021)
  • 著者名/発表者名: Tan Toong Seng、Toyoda Mako、Tokunaga Kenzo、Ueno Takamasa
  • 雑誌名: Journal of Virology 巻: 95 号: 18
  • DOI: 10.1128/jvi.00634-21
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] SARS-CoV-2 B.1.617 Mutations L452R and E484Q Are Not Synergistic for Antibody Evasion (2021)
  • 著者名/発表者名: Ferreira IATM, Kemp SA, Datir R, Saito A, Meng B, Rakshit P, Takaori-Kondo A, Kosugi Y, Uriu K, Kimura I, Shirakawa K, Abdullahi A, Agarwal A, Ozono S, Tokunaga K, Sato K, Gupta RK
  • 雑誌名: The Journal of Infectious Diseases 巻: 224 号: 6 ページ: 989-994
  • DOI: 10.1093/infdis/jiab368
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Phenotypic and Genotypic Co-receptor Tropism Testing in HIV-1 Epidemic Region of Tanzania Where Multiple Non-B Subtypes Co-circulate (2021)
  • 著者名/発表者名: Judicate George P.、Barabona Godfrey、Kamori Doreen、Mahiti Macdonald、Tan Toong Seng、Ozono Seiya、Mgunya Amina Shaban、Kuwata Takeo、Matsushita Shuzo、Sunguya Bruno、Lyamuya Eligius、Tokunaga Kenzo、Ueno Takamasa
  • 雑誌名: Frontiers in Microbiology 巻: 12 ページ: 703041-703041
  • DOI: 10.3389/fmicb.2021.703041
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] SARS-CoV-2 B.1.617.2 Delta variant replication and immune evasion (2021)
  • 著者名/発表者名: Mlcochova Petra、Kemp Steven A.、Dhar Mahesh Shanker他
  • 雑誌名: Nature 巻: 599 号: 7883 ページ: 114-119
  • DOI: 10.1038/s41586-021-03944-y
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Enhanced fusogenicity and pathogenicity of SARS-CoV-2 Delta P681R mutation (2021)
  • 著者名/発表者名: Saito Akatsuki、Irie Takashi、Suzuki Rigel、Maemura Tadashi、Nasser Hesham、Uriu Keiya、Kosugi Yusuke、Other 43 authors、Tanaka Shinya、Nakagawa So、Ikeda Terumasa、Fukuhara Takasuke、Kawaoka Yoshihiro、Sato Kei、The Genotype to Phenotype Japan (G2P-Japan) Consortium
  • 雑誌名: Nature 巻: 602 号: 7896 ページ: 300-306
  • DOI: 10.1038/s41586-021-04266-9
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [学会発表] SARS-CoV-2関連コウモリコロナウイルスの宿主指向性を規定する因子の同定． (2023)
  • 著者名/発表者名: 1.小杉優介、藤田滋、木村出海、徳永研三、伊東潤平、佐藤佳
  • 学会等名: 第70回日本ウイルス学会
• [学会発表] The development of in vitro HIV-1 latency models using a viral minigene system. (2023)
  • 著者名/発表者名: Dechuan Kong, Seiya Ozono, Masanori Kameoka, Takamasa Ueno, Kenzo Tokunaga.
  • 学会等名: 第70回日本ウイルス学会
• [学会発表] HIV-1 minigene system to establish an in vitro latency model. (2023)
  • 著者名/発表者名: Dechuan Kong, Seiya Ozono, Masanori Kameoka, Takamasa Ueno, Kenzo Tokunaga.
  • 学会等名: 24th Kumamoto AIDS Seminar
• [学会発表] 結合型ユビキチンリガーゼRNF152によるチロシナーゼのユビキチン化分子機構解明に関する研究 (2022)
  • 著者名/発表者名: 上田亮太、大園誠也、藤井佑樹、高橋宏隆、竹田浩之、澤崎達也、本川智紀、徳永研三、藤田英明
  • 学会等名: 第30回日本色素細胞学会
• [学会発表] Further Characterization of the antiviral transmembrane protein MARCH8 (2022)
  • 著者名/発表者名: Takuya Tada, Yanzhao Zhang, Weitong Yao, Michiko Tanaka, Dechuan Kong, Takamasa Ueno, Masanori Kameoka, Hideaki Fujita, and Kenzo Tokunaga
  • 学会等名: 第69回日本ウイルス学会
• [学会発表] Molecular mechanisms of tyrosinase recognition, ubiquitination and degradation by membrane-bound ubiquitin ligase. RNF152 (2021)
  • 著者名/発表者名: Ryota Ueda, Seiya Ohzono, Yuki Fujii, Hirotaka Takahashi, Hiroyuki Takeda, Sawasaki Tatsuya, Tomonori Motokawa, Kenzo Tokunaga, and Hideaki Fujita.
  • 学会等名: 第29回日本色素細胞学会
• [学会発表] Aromatic side chain at position 412 of SERINC5 exerts restriction activity toward HIV-1 and other retroviruses. (2021)
  • 著者名/発表者名: Toong Seng Tan, Mako Toyoda, Kenzo Tokunaga, Takamasa Ueno.
  • 学会等名: 22nd Kumamoto AIDS Seminar
• [学会発表] 膜結合型ユビキチンリガーゼRNF152によるメラニン産生調節機構に関する研究 (2021)
  • 著者名/発表者名: 上田亮太、大園誠也、藤井佑樹、高橋宏隆、竹田浩之、澤崎達也、本川智紀、徳永研三、藤田英明
  • 学会等名: R3年度日本薬学会九州支部特別講演会
• [学会発表] MARCH8 targets cytoplasmic lysine residues of various viral envelope glycoproteins. (2021)
  • 著者名/発表者名: Yanzhao Zhang, Seiya Ozono, Takuya Tada, Minoru Tobiume, Masanori Kameoka, Satoshi Kishigami, Hideaki Fujita, and Kenzo Tokunaga.
  • 学会等名: 第68回日本ウイルス学会
• [学会発表] The application of the HiBiT-based lentiviral system to SARS-CoV-2 studies. (2021)
  • 著者名/発表者名: Kenzo Tokunaga.
  • 学会等名: 第35回日本エイズ学会（日仏合同シンポジウム）
• [学会発表] Aromatic side chain at position 412 of SERINC5 exerts restriction activity toward HIV-1 and other retroviruses. (2021)
  • 著者名/発表者名: Toong Seng Tan, Mako Toyoda, Kenzo Tokunaga, Takamasa Ueno.
  • 学会等名: 第35回日本エイズ学会
• [学会発表] MARCH8 downregulates various viral envelope glycoproteins by targeting their cytoplasmic lysine residues. (2021)
  • 著者名/発表者名: Yanzhao Zhang, Seiya Ozono, Takuya Tada, Minoru Tobiume, Masanori Kameoka, Satoshi Kishigami, Hideaki Fujita, and Kenzo Tokunaga.
  • 学会等名: 第44回日本分子生物学会
• [備考] MARCH8は様々なウイルスエンベロープ糖蛋白質の細胞質領域リジン残基を標的とする
  • URL: https://www.niid.go.jp/niid/ja/basic-science/virology/10905-vir-2022-01.html