| 研究課題/領域番号 |
21K07201
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分50020:腫瘍診断および治療学関連
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| 研究機関 | 新潟医療福祉大学 |
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研究代表者 |
川村 宏樹 新潟医療福祉大学, 医療技術学部, 教授 (20333495)
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| 研究分担者 |
高橋 雅彦 新潟大学, 医歯学系, 准教授 (80377192)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2023年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2022年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2021年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
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| キーワード | 抗CD38 抗体 / 分子標的試薬 / 多発性骨髄腫 / 輸血検査 / ダラツムマブ / CD38 / 分子標的薬 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
再発・難治性の多発性骨髄腫の治療薬として2017年に臨床許可されダラツムマブ（DARA）は、腫瘍化で細胞上に発現するCD38をターゲットとする分子標的薬で、その効果から需要が高まっている。CD38は赤血球にも発現していため、DARA投与患者の輸血検査に干渉して偽陽性となり結果判定に影響を与え問題となっている。対処法として血球試薬のDTT処理が推奨さているが課題もあり、更なる改善が求められている。そこで本研究ではDARAがCD38の分子標的薬であることを逆手にとる発想から、CD38陽性の骨髄腫細胞株を用いて血漿からDARA（抗CD38抗体）を吸収処理で取り除く新規除去法の確立を目指す。
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| 研究実績の概要 |
【目的】再発・難治性の多発性骨髄腫の治療薬として臨床許可されダラツムマブ（DARA）は、腫瘍化で細胞上に発現するCD38をターゲットとする分子標的薬である。CD38は赤血球にも発現していため、DARA投与患者の輸血検査に干渉して偽陽性となり結果判定に影響を与え問題となっている。本研究は赤血球試薬に影響を与えず、DARA投与患者の輸血検査において簡易法で保存可能な腫瘍細胞由来の吸収試薬の開発に結び付く基礎技術の確立を目的とする。令和4年度（2年目）は骨髄腫細胞株を用いて、PBSまたはト血漿にDARAを加えた模擬検体をカラム凝集法でDARAの吸収条件検討と吸収効率を検討した。また上記の検体に不規則抗体陽性FFPを加え、検出に与える影響を検討した。
【成果】初めに前年度検討した試験管法（PEG-IAT）においてDARAの模擬検体濃度1,000～1μg/mLでは1+～W+で大きな差は認められず、また手技の差のためか結果にバラつきあった。そこで本年はカラム凝集法を用いて、再検討を実施した。その結果、スクリーニング血球間で差はあるものの0.1μg/mL～100μg/mLで1+～2+の凝集強度が認められたが、濃度によって凝集強度に大きな差は認められなかった。次にCD38陽性骨髄腫細胞株のα細胞とβ細胞を用いて、37℃で吸着時間を1時間、3時間、6時間と時間を振って吸着試験をおこなった。その結果、β細胞で6時間のみ1μg/mLと10μg/mLで1+がW+に凝集強度が低下した。しかし残念ながら陰性までの条件の決定には至っていない。次に抗E、抗Diaの不規則抗体陽性FFPをPBSで1+またはW+かつDARA濃度10μg/mLに調整した検体を吸着実施と未実施で、不規則抗体検査に与える影響を検討した。その結果、対象を置けば見分けられるレベルなので実用化できるようにさらなる検討をおこなう予定である
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
計画がやや遅れている原因は３つある。1つ目は、1年目に引き続きCD38陽性骨髄腫細胞株に模擬検体中のDARAの吸着条件が確定できていないことである。「５．研究実績の概要」に記入したように吸着効率は改善されたが、実用レベルではない。DARA全量を腫瘍細胞株に吸着でき安定性にているとは言えず、更なる検討が不可欠である。これが本研究の最重要項目なので、現在、細胞株の再クローニングをおこなっており、CD38強発現の細胞の確立を目指している。また吸着方法も混合法だけでなくプレート法も検討しているので、多面的に検討を重ね吸着条件を確定したい。2つ目は、吸着方法の方向性が定まっていないことである。2年目はカラム凝集法をおこなえるようになったので、試験管法よりも手技の安定化と結果の客観的判定ができるようになった。そこで吸着条件検討を凝集の強度を用いて判定を試みた。しかし吸着条件は、温度、時間、腫瘍株の細胞数、振とう条件、DARAの濃度など改善ポイントいくつもあるのでどの条件を改良すると吸着率が上がるのか、凝集強度のみでは方向性が正しいのかの判断が難しかった。このことから吸着の客観性、数値化の必要性を強く感じ、数値化できれば検討を更に進める方向性の目安になると考えられた。３つ目は医療機関と共同研究をおこなう予定であったがコロナ禍で共同研究が進まず、臨床の意見を踏まえた検討が滞ってしまった。これら3つの遅れている点は「８．今後の研究の推進方策」に記載しているように既に改善すべく取り組んでおり、遅れを取り戻せると思われる。2年目の問題点とその改善策を見出して取り組んでいるので、本研究はやや遅れていると考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
昨年度の進行状況や結果を踏まえて今年度は、１．CD38強発現の腫瘍細胞株の再クローニング、２． DARA吸着の吸着率の数値化の検討、３．骨髄腫細胞株にDARA以外の不規則抗体が吸収するか否かの検討、４．DARA使用患者血清を用いた吸着率の検討の４つを中心に研究に取り組む。
１．CD38強発現の腫瘍細胞株の再クローニング： これは本研究の最重要項目なので、腫瘍株のリミッティングダイリューションをすることで単クローン性をおこなう。その後にフローサイトメトリーを用いてCD38の発現状況を判別して、CD38強発現細胞株を樹立する。
２．DARA吸着の吸着率の数値化の検討：当初予定していた吸着方法を複数検討したが、陰性になる方法が確立できていない。そこで吸着率を数値化できれば加温時間を延ばすことが有用なのか、細胞数の増加が有用なのかなど方法性の指標ができ、吸着の安定性に結びつくと考えられる。この点ではCD38陽性骨髄腫細胞株との混合法では抗γ鎖抗体で染色してフローサイトメトリーを用いて数値化して、細胞固相化をするプレート法は同抗体で蛍光顕微鏡を用いて数値化して吸着法の方向性を示す予定である。
３．骨髄腫細胞株にDARA以外の不規則抗体が吸収するか否かの検討： ヒト血漿に既知の不規則抗体を加えた模擬検体を作製して、カラム凝集法で添加した不規則抗体が検出できるか検討する。添加する不規則抗体は抗E、抗Dia、抗Jka、抗Jkb、抗Fya、抗FybなどのFFPや市販されているポリクローナル抗体を利用する。
４．DARA使用患者血清を用いた吸着率の検討： １～３の結果を踏まえて、実用化の可能性があるのかを医療機関と共同研究をおこなう。現場の技師の意見を聞き、臨床に貢献できる方向性を検討する。
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