甘草の副作用、偽アルドステロン症の発症予測のための検査キットの開発

研究課題

研究課題/領域番号	21K07357
研究種目	基盤研究(C)
配分区分	基金
応募区分	一般
審査区分	小区分52010:内科学一般関連
研究機関	第一薬科大学
研究代表者	森永紀第一薬科大学, 薬学部, 教授 (60465771)
研究分担者	牧野利明名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(薬学), 教授 (80326561) 小川鶴洋第一薬科大学, 薬学部, 講師 (40781646) 大磯茂長崎国際大学, 薬学部, 教授 (40513106)
研究期間 (年度)	2021-04-01 – 2024-03-31
研究課題ステータス	交付 (2022年度)
配分額 *注記	4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円) 2023年度: 780千円 (直接経費: 600千円、間接経費: 180千円) 2022年度: 1,820千円 (直接経費: 1,400千円、間接経費: 420千円) 2021年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
キーワード	偽アルドステロン症 / 漢方薬 / 甘草 / 硫酸抱合体 / モノクローナル抗体 / ELISA / 検査キット / 副作用の予防
研究開始時の研究の概要	抗18β-glycyrrhetyl-3-O-sulfateモノクローナル抗体（抗GA3S-MAb）を作製し、免疫化学的測定法による GA3S の定量的測定法を開発する。偽アルドステロン症発症のヒト血中の代謝産物3濃度の閾値は、1マイクロM前後と予想している。しかしながら、副作用を発症しなかった患者でも血中から GA3S を検出していることから、GA3Sが血中に現れている患者が副作用を発症しやすいとは言えず、その血中濃度の閾値が副作用発症を予測するうえで重要となる。そこで、GA3Sの濃度が、5から0.1マイクロMの間の濃度で閾値が設定できるキットを開発し、臨床データと合わせて実用化を目指す。
研究実績の概要	偽アルドステロン症 (PAism)の原因物質はこれまで3-monoglucuronyl glycyrrhetinic acid (3MGA)によるものと考えられてきた. しかし、近年の3MGAに対するモノクローナル抗体(MAb)を用いた動物実験及びヒト血清サンプルの分析で, glycyrrhetinic acid (GA)の硫酸抱合体である18β-glycy-rrhetyl-3-O-sulfate(GA3S)が原因物質の可能性が高いことが報告されている. 抗3MGA MAbはGA誘導体に交差反応性を示すため、より特異的にGA3Sを認識するMAbの作製が望まれており, そのMAbを用いればPAism発症予測用検査キットの開発にも応用できる可能性がある. 本研究では, GA3Sコンジュゲート(GA3S-Conj)を用いて免疫処置したマウスの血清を用いた競合的ELISA法でGA3Sを特異的に認識する抗体が分泌されるかを調査した.
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 3: やや遅れている理由 GA3Sとキャリアタンパク質(CP)であるKLH及びHSAはカルボジイミド法を用いてGA3S-Conjを調製した. GA3S-KLHを免疫原として初回はフロイント完全アジュバント, 二回目はフロイント不完全アジュバントとともにBalb/c雌性マウスに腹腔内投与した. その後二週間おきにGA3S-KLHを腹腔内投与した. 免疫処置マウス尾静脈より採血して血清を用いて、競合的ELISA法で抗GA3S抗体が分泌されているかを検討し、GA3Sに特異的な抗体の誘導をマウス血清で確認出来たが、細胞融合が未実施であり、モノクローナル抗体作製が完結していないので、やや遅れている理由であr。
今後の研究の推進方策	12次免疫後のマウス血清を用いてGA3S-Conj, HSA, BSA, KLHを固相化抗原とした場合の反応性を間接ELISA法で確認した. その結果, GA3S-KLHで最も吸光度が高く, 次いでGA3S-HSA, KLH, HSA, BSAと続いた. KLHの吸光度はGA3S-KLHの約0.5倍であったので, 抗体認識部位がGA3S-KLHのGA3S部か, KLH部かを判断できなかった. 一方で, HSAの吸光度はGA3S-HSAの約0.1倍であったので, GA3S-HSAを固相化抗原に用いた. GA3S, 3MGA, glycyrrhizin (GL), cholesterol (CH), corticosterone (CR)について競合的ELISA法で分析したところ, 50 μg/mL GA3Sと競合させた際に約90%の阻害率を示した. 一方で、GLや3MGAと競合させた際の阻害率はそれぞれ約6%, 3%であり、GA誘導体が複数存在する条件でも選択的にGA3Sを認識できる可能性が示唆された. また, CHでは阻害は観察されなかったが, CRでは約16%の阻害率が観察された. CRがGA3Sと同一の抗体に認識されるかは現時点では明らかではないが, 今後のMAb作製における検討で抗体の性質および, CRに対する反応性に関しても明らかにし、簡易分析キットの作成のためのモノクローナル抗体の作製を急務としている。その後は、本抗体を用いた分析キットの開発を進める計画である。