| 研究課題/領域番号 |
21K07422
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分52020:神経内科学関連
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| 研究機関 | 京都府立医科大学 |
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研究代表者 |
渡邊 義久 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (50363990)
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| 研究分担者 |
田口 勝敏 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (60462701)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
完了 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2023年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2022年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
2021年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
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| キーワード | オートファジー / α-シヌクレイン / Rubicon / Atg7 / 神経変性疾患 / Beclin1 / UVRAG / ハイスループットスクリーニング / Beclin1複合体 / 治療薬 / Basal Autophagy / 治療薬スクリーニング / Beclin-1 / NanoBiT |
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| 研究開始時の研究の概要 |
神経変性疾患の多くは脳内に有害な異常タンパク質が蓄積することで発症する。オートファジー亢進薬Rapamycinはそのようなタンパク質の除去に効果的であるが、免疫抑制作用や細胞死などの副作用がある。本研究ではマイルドにオートファジー活性を亢進し、継続的に使用可能な薬剤のスクリーニングを行う。そのために、オートファジー主要因子Beclin-1とその調節因子をターゲットにしたBasal Autophagy活性化薬剤のスクリーニング系の開発を行う。具体的にはBeclin-1とその調節因子との相互作用を高感度検出システムを用いて定量化し、化合物ライブラリーを用いて新しい神経変性疾患治療薬の開発を目指す。
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| 研究実績の概要 |
昨年度作製したATG7とRubiconノックアウト細胞で種々の神経変性疾患モデルを作製した。パーキンソン病モデルとしてα-Synuclein-GFP、アルツハイマー病モデルとしてTau_P301L(RD)-GFPを発現させ、in vitroで作製したα-SynucleinまたはTau(3R) PFFをリポフェクトアミンで導入し、GFPを指標としてフローサイトメーターで凝集体の測定を行った。ATG7 KO細胞ではα-Synuclein-GFPとTau_P301L(RD)-GFPの凝集体形成の促進が確認できた。さらに、迅速にオートファジーFluxを測定するためにGFP-LC3-RFPをレポーターとしてフローサイトメーターで蛍光タンパク質を測定した。ATG7KOやRubicon KO細胞でGFP-LC3-RFPを安定発現させ、リソソーム阻害剤バフィロマイシンA1の処理などを行った後、細胞をトリプシン処理してフローサイトメーターでオートファジー活性を測定した。ダイナミックレンジは狭いが、高い精度でオートファジーfluxを測定することができた。今後、Beclin1やUVRAGなどの過剰発現の影響なども調べる。また、カテプシンLの発現によるオートファジー活性もこのシステムで測定し、過剰発現により有意に活性化することが明らかになった。
オートファジー関連タンパク質の１つであるWDR45とオートファジー活性の関連性を調べた。WDR45遺伝子のノックアウト細胞を作製しオートファジー活性を測定したところ、有意な変化は認められなかった。一方、ミトコンドリアやリソソームの形態を免疫染色で間作したところ、リソソームの凝集化が観察された。
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