標的ゲノム編集/系統的ノックダウンによる染色体転座頻度を増加させる因子の探索

• 研究課題/領域番号: 21K07681
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 基金
• 応募区分: 一般
• 審査区分: 小区分52040:放射線科学関連
• 研究機関: 広島大学 (2023); 福島県立医科大学 (2021-2022)
• 研究代表者: 津山 尚宏 広島大学, PSI GMP教育研究センター, 主幹特任学術研究員 (10335747)
• 研究分担者: 阿部 悠 長崎大学, 原爆後障害医療研究所, 助教 (00722472) ; 工藤 健一 福島県立医科大学, 医学部, 助教 (00805799) ; 坂井 晃 福島県立医科大学, 医学部, 教授 (70284221)
• 研究期間 (年度): 2021-04-01 – 2025-03-31
• 研究課題ステータス: 交付 (2023年度)
• 配分額: 4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円); 2023年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円); 2022年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円); 2021年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
• キーワード: 染色体転座 / CRISPR-Cas9 / 電離放射線 / 放射線感受性 / 責任遺伝子 / CRISPR/Cas9

研究開始時の研究の概要

電離放射線はDNA二本鎖切断を介して染色体異常を引き起こすが、分子機構の全体像は不明である。本研究では若い健常人の末梢血リンパ球に自然に生じた染色体転座頻度の分散と放射線誘発転座頻度の個人差を解析し、正常ヒト集団の染色体転座頻度を得る。
並行して染色体転座の分子機構解析を試みる。我々が樹立したt(11;14)転座誘導系を用い、既知遺伝子異常のヘテロ接合性の影響、DNA二本鎖切断(DSB)修復シグナル・ゲノム不安定性を修飾する代謝やレドックス制御シグナルの系統的なノックダウンによる影響、未知の機序解明のため全ゲノムノックアウトライブラリー導入による易転座誘発性の標的同定を行い、機序の理解を目指す。

研究実績の概要

電離放射線は細胞ゲノムにDNA二本鎖切断を誘発する。DNA二本鎖切断修復の過程で、ランダムな染色体異常が線量依存的に生じるが、本来の切断末端ではなく異なる切断末端同士が再結合して染色体異常（転座や二動原体染色体など）が生じる分子機構の全体像は不明である。加えて、Ph1など特定の染色体転座は疾病の原因となるため、染色体転座を促進する機構の解明は重要である。本研究ではこの機序を明らかにするため、解析を継続している。
本研究ではまず、正常ヒト集団の自然に生じる染色体転座頻度の多人数解析、さらに同一検体を用いた放射線誘発染色体転座頻度について、研究計画書に基づきICを得て単離した若い健常人の末梢血リンパ球を用いて、自然に生じた染色体転座頻度のベースラインと同一検体の放射線誘発された転座頻度を解析している。
また並行して、培養細胞を用いて染色体転座の分子機構解析が進行中である。転座誘導系としてCRISPR-Cas9を用いたt(11;14)に加えt(11;22), t(5;6)転座誘導系を作成した。これを培養細胞に導入して転座を誘導し、頻度を各々の転座に特異的な、ゲノムDNAに設定したプライマーを用いたリアルタイムPCRでモニターしている。CRISPR-Cas9で転座誘発する細胞は、DNA二本鎖切断(DSB)修復シグナル・ゲノム不安定性、放射線感受性を修飾する責任遺伝子、代謝やレドックス制御シグナル分子群について、特異的阻害剤処理やレトロウイルスshRNA発現ベクターによる系統的なノックダウンを予め行い、転座頻度の変化を観察している。
未知の機序解明のため全ゲノムCRISPR-Cas9ノックアウトライブラリー導入による易転座誘発性の獲得と標的同定を行っている。

現在までの達成度 (区分)

4: 遅れている

理由

健常若年者集団における自然/放射線誘発線染色体転座頻度の解析については、全ての検体について非照射・0.2,1Gy照射検体のFISH標本を作製してMetaferシステムによる5000メタフェーズ以上の画像取り込みを完了し、染色体異常頻度解析を逐次進めており、次年度に完了させる予定である。
本研究のために作成したCRISPR-Cas9によるt(11;14), t(11;22), t(5;6)転座誘導系は培養細胞に導入して染色体転座が誘導されることを確認し、shRNA発現ウイルスベクターを導入した細胞に対し転座誘導ベクターを導入して、転座頻度解析を行っている。
全ゲノムCRISPR-Cas9ノックアウトライブラリー導入のために、ウイルスパッケージング条件、および導入条件の最適化を行っている。

今後の研究の推進方策

研究計画書の内容に従い、次年度中に解析を完了させる。

研究成果

• [雑誌論文] Influence of matrix effects by inorganic ions in single-cell direct mass spectrometry (2023)
  • 著者名/発表者名: Kato Y, Kudoh S, Sugiyama E, Sakane I, Tsuyama N, Toyo’oka T, Todoroki K, Hajime Mizuno
  • 雑誌名: Medical Mass Spectrometry 巻: 7 号: 1 ページ: 43-52
  • DOI: 10.24508/mms.2023.06.003
  • ISSN: 2432-7441, 2432-745X
  • 年月日: 2023-06-25
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] RENEB Inter-Laboratory Comparison 2021: Inter-Assay Comparison of Eight Dosimetry Assays (2023)
  • 著者名/発表者名: Port M, Barquinero JF, Endesfelder D, Moquet J, Oestreicher U, Terzoudi G, Trompier F, Vral A, Abe Y, Ainsbury L, Alkebsi L, Amundson SA, Badie C, Baeyens A, Balajee AS, Balazs K, Barnard S, Bassinet C, Beaton-Green LA, Beinke C, Bobyk L, Brochard P, Brzoska K, Bucher M, Ciesielski B, Cuceu C, Discher M et al.
  • 雑誌名: Radiation Research 巻: 199 号: 6 ページ: 535-555
  • DOI: 10.1667/rade-22-00207.1
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] No increase in translocated chromosomal aberrations, an indicator of ionizing radiation exposure, in childhood thyroid cancer in Fukushima Prefecture. (2023)
  • 著者名/発表者名: Sakai A, Tsuyama N, Ohira T, Sugai-Takahashi M, Ohba T, Azami Y, Matsumoto Y, Iwadate Manabu, Suzuki S, Sato M, Hosoya M, Ishikawa T, Suzuki S.
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 13 号: 1 ページ: 14254-14254
  • DOI: 10.1038/s41598-023-41501-x
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] RENEB Inter-Laboratory Comparison 2021: The Dicentric Chromosome Assay. (2023)
  • 著者名/発表者名: Endesfelder D, Oestreicher U, Bucher M, Beinke C, Siebenwirth C, Ainsbury E, Moquet J, Gruel G, Gregoire E, Martinez JS, Vral A, Baeyens A, Valente M, Montoro A, Terzoudi G, Triantopoulou S, Pantelias A, Monteiro Gil O, Prieto MJ, Domene MM, Zafiropoulos D, Barquinero JF, Pujol-Canadell M, Lumniczky K et al.
  • 雑誌名: Radiation Research 巻: 199 号: 6 ページ: 556-570
  • DOI: 10.1667/rade-22-00202.1
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] RENEB Inter-Laboratory Comparison 2021: The FISH-Based Translocation Assay (2023)
  • 著者名/発表者名: Barquinero JF, Abe Y, Aneva N, Endesfelder D, Georgieva D, Goh V, Gregoire E, Hristova R, Lee Y, Martinez JS, Meher PK, Miura T, Port M, Pujol-Canadell M, Prieto-Rodriguez MJ, Seong KM, Suto Y, Takebayashi K, Tsuyama N, Wojcik A, Yoon HJ, Abend M.
  • 雑誌名: Radiation Research 巻: 199 号: 6 ページ: 583-590
  • DOI: 10.1667/rade-22-00203.1
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Chromosomal translocation t(11;14) and p53 deletion induced by the CRISPR/Cas9 system in normal B cell-derived iPS cells (2021)
  • 著者名/発表者名: Yusuke Azami, Naohiro Tsuyama, Yu Abe, Misaki Sugai-Takahashi, Ken-Ichi Kudo, Akinobu Ota, Karnan Sivasundaram , Moe Muramatsu, Tomonari Shigemura, Megumi Sasatani, Yuko Hashimoto, Shigehira Saji, Kenji Kamiya, Ichiro Hanamura, Takayuki Ikezoe, Masafumi Onodera, Akira Sakai.
  • 雑誌名: Sci Rep 巻: 11 号: 1 ページ: 5216-5216
  • DOI: 10.1038/s41598-021-84628-5
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] Analysis of differential gene expression in t(11;14) carrying iPS cells induced by genome editing and Cre-loxP (2023)
  • 著者名/発表者名: Naohiro Tsuyama, Yu Abe, Misaki Sugai Takahashi, Kenji Kamiya, Akira Sakai
  • 学会等名: The 7th International Symposium of the Network-type Joint Usage/Research Center for Radiation Disaster Medical Science
  • 国際学会
• [学会発表] Analysis of differential gene expression in t(11;14) carrying iPS cells induced by genome editing (2022)
  • 著者名/発表者名: Naohiro Tsuyama, Kenichi Kudo, Misaki Sugai Takahashi, Yusuke Azami, Kenji Kamiya, Akira Sakai.
  • 学会等名: 第65回日本放射線影響学会
• [学会発表] Optimization of chromosome specimen preparation for biodosimetry using chromosome aberration frequency. (2021)
  • 著者名/発表者名: Naohiro Tsuyama, Yu Abe, Misaki Sugai-Takahashi, Kenichi Kudo, Yusuke Azami, Miwa Fukami, Tomisato Miura, Kenji Kamiya, Akira Sakai
  • 学会等名: 第64回日本放射線影響学会
• [学会発表] Study for exploring myeloma-initiating cell using normal B cell-derived iPS cells. (2021)
  • 著者名/発表者名: Yusuke Azami, Naohiro Tsuyama, Yu Abe, Misaki Sugai-Takahashi, Ken-ichi Kudo, Miwa Fukami, Akinobu Ota, Karnan Sivasundaram, Moe Muramatsu, Tomonari Shigemura, Megumi Sasatani, Yuko Hashimoto, Shigehira Saji, Kenji Kamiya, Ichiro Hanamura, Takayuki Ikezoe, Masafumi Onodera, Akira Sakai
  • 学会等名: 第83回日本血液学会学術集会