| 研究課題/領域番号 |
21K07743
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分52050:胎児医学および小児成育学関連
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| 研究機関 | 弘前大学 |
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研究代表者 |
神尾 卓哉 弘前大学, 医学部附属病院, 助教 (50587011)
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| 研究分担者 |
土岐 力 弘前大学, 医学研究科, 講師 (50195731)
金崎 里香 弘前大学, 医学研究科, 助教 (60722882)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2023年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
2022年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2021年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
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| キーワード | Diamond-Blackfan貧血 / 悪性腫瘍 / リボソーム / 難病プラットフォーム / 造血不全モデルマウス / MDM2 / p53 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
1. DBAモデルマウス、造血不全モデルマウスから発症した悪性腫瘍を病理学的に検討。悪性腫瘍が浸潤している組織からゲノムDNA、RNAを抽出し、腫瘍細胞に起きている体細胞変異の同定をエクソーム解析、ターゲットRNAシーケンスにて行う。同定された変異がドライバー変異か否か、機能解析を行う。
2. 悪性腫瘍合併DBA患者の腫瘍病理組織から、上記と同様の機能解析を行う。
3. 研究代表者らが構築した先天性骨髄不全レジストリに登録されているDBA悪性腫瘍非合併例をフォローアップし、臨床データの蓄積と基礎研究使用の準備を行う。
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| 研究実績の概要 |
我々の研究の目的は、DBAモデルマウス、造血不全モデルマウス、当科で遺伝子解析されたDBA患者で悪性腫瘍が発症した症例の腫瘍病理組織を用いることによって、DBAに合併する悪性腫瘍の発症機構を解明することである。具体的には、以下のステップで研究を進める予定である。
1. DBAモデルマウス、造血不全モデルマウスから発症した悪性腫瘍を病理学的に検討。悪性腫瘍が浸潤している組織からゲノムDNA、RNAを抽出し、腫瘍細胞に起きている体細胞変異の同定をエクソーム解析、ターゲットRNAシーケンス（RNA-seq）にて行う。同定された変異がドライバー変異か否か、機能解析を行う。2.悪性腫瘍合併DBA患者の腫瘍病理組織から、上記と同様の機能解析を行う。3. 先天性骨髄不全レジストリに登録されているDBA悪性腫瘍非合併例をフォローアップし、臨床データの蓄積と基礎研究使用の準備を行う。
我々は、令和2年10月、難病プラットフォームを用いDBAを含む先天性造血不全症候群レジストリを構築した。これまでに悪性腫瘍を合併していないDBA患者が、新たに悪性腫瘍の合併がないかどうか慎重にフォローアップ調査を行い、臨床データの蓄積と今後の基礎研究使用の準備を行う。
令和3年度には、DBAを含む先天性造血不全症候群レジストリから悪性腫瘍の合併の有無およびフォローアップ調査を行い、臨床データの蓄積および解析を行った。
令和4年度には、難病プラットフォームに新規DBA症例の登録、DBA患者で悪性腫瘍が発症した症例の腫瘍病理組織を用いるための準備および解析の予備実験を計画した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
令和3年度にはRps6flox/flox、Mx-cre、MDM2C305Fマウスの凍結精子を用いて体外受精を行い、レシピエントマウスに移植、個体復元を行い、産子はPCRジェノタイピングされ、交配によりDBAモデルマウス、造血不全モデルマウスを得る予定であったが、マウスの実験が滞ってしまった。そのため、令和3年度には当初令和5年度に予定していた、DBAを含む先天性造血不全症候群レジストリから悪性腫瘍の合併の有無およびフォローアップ調査を行い、臨床データの蓄積および解析を行った。
令和4年度もマウスの研究が進まなかったため、令和3年度に続いた研究を行うことにした。令和3年度の研究で抽出された悪性腫瘍合併DBA患者症例の腫瘍病理組織を用いるための準備および解析の予備実験を始めている。また、新規症例の登録も逐次進めている。
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| 今後の研究の推進方策 |
＜令和5年度＞倫理委員会でDBAの遺伝子解析について承認された悪性腫瘍合併DBA患者の腫瘍病理組織より、ゲノムDNA、RNAを抽出。腫瘍細胞に起きている体細胞変異の同定をエクソーム解析、RNA-seqにて、体細胞変異の同定、遺伝子発現情報、バリアントコール、既知および新規の遺伝子融合因子との融合の検出を試みる。同定された変異がドライバー変異か否か、遺伝子変異をゲノム編集CRISPR/Cas9法を用いて研究分担者らが樹立したTP53変異を有する赤芽球癆のiPS細胞株やヒト骨肉腫細胞株U-2 OSに導入し、機能解析を行う。
Rps6flox/flox、Mx-cre、MDM2C305Fマウスの凍結精子を用いて体外受精を行い、レシピエントマウスに移植、個体復元を行う。産子はPCRジェノタイピングされ、交配によりDBAモデルマウス、造血不全モデルマウスを得る。悪性腫瘍発症まで飼育し、腫瘍を摘出、ホルマリン固定。腫瘍は病理学的に検討され、組織よりゲノムDNA、RNAを抽出。腫瘍細胞に起きている体細胞変異の同定をエクソーム解析にて行う。また、RNA-seqを用いてライブラリーを作成、シーケンスを取得後、TopHatを用いてアライメントを行い、遺伝子発現情報、バリアントコール、既知および新規の遺伝子融合因子との融合の検出を試みる。同定された変異がドライバー変異か否か、遺伝子変異をゲノム編集CRISPR/Cas9法を用いてRps6flox/flox; MxcreマウスやMDM2C305F変異マウス胎児線維芽細胞（MEF）に導入し、機能解析を行う。
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