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迅速なモデルマウス作出により遺伝性疾患で検出される意義不明なゲノム変異を診断する

研究課題

研究課題/領域番号 21K07880
研究種目

基盤研究(C)

配分区分基金
応募区分一般
審査区分 小区分52050:胎児医学および小児成育学関連
研究機関愛知県医療療育総合センター発達障害研究所

研究代表者

林 深  愛知県医療療育総合センター発達障害研究所, 遺伝子医療研究部, 部長 (50596244)

研究期間 (年度) 2021-04-01 – 2025-03-31
研究課題ステータス 交付 (2023年度)
配分額 *注記
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2023年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2022年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2021年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
キーワードゲノム編集 / VUS / 疾患モデルマウス / 臨床遺伝学 / 発達障害 / てんかん / ゲノム医学 / 遺伝性疾患 / 病的意義の不明なゲノム変異 / i-GONAD
研究開始時の研究の概要

神経発達症やてんかんなどの発達障害を呈する遺伝性疾患の多くは長らく原因が不明であったが、近年急速に発達したゲノム解析技術により、疾患の原因となるゲノム変異が検出されるようになった。しかし同時に、疾患の原因であるかどうか明らかではないゲノム変異も多数が検出されるようになり、これらを解釈する方法は確立していない。そこで本研究では、当該ゲノム変異を正確に模した遺伝子改編マウスをゲノム編集技術により迅速に作出して疾患原因か否かを直接的に判定し、遺伝性疾患を診断し、病態を明らかにすることを目的とする。これらの知見は治療法開発や遺伝カウンセリングなどに寄与することも期待できる。

研究実績の概要

本研究の目的は、神経発達症やてんかんなど、主に発達障害を呈する遺伝性疾患のゲノム解析において見いだされる病的意義の不明なゲノム変異 (VUS)を評価し、そのバリアントがタンパク・細胞・組織・生体レベルで引き起こす病態機序を理解することである。この目的のため、ゲノム編集試薬を妊娠マウスの受精卵に直接導入し、遺伝子改変マウスを最短19日で作出する技法であるi-GONAD法により標的とするVUSを正確に模したモデルマウスを迅速かつ正確に作出することによって、当該VUSが個体・組織レベルでどのように遺伝子機能を障害し、発生発達に影響するかを評価してきた。
本年度までの施行により、14遺伝子における16系統のモデルマウス作出に成功し、漸次解析を行っている。一例として、てんかん・発達遅滞の家系例に見いだされたTENM4のスプライシング領域のVUSを挙げる。TENM4のミスセンスまたは機能喪失型変異は本態性振戦の原因となることがすでに知られているが、本症例とは明らかに表現型が異なる。しかし、本VUSを正確に模したマウスモデルはpentylenetetrazole誘発による著明なてんかん感受性の亢進や脳梁の菲薄化を示し、本VUSが表現型の原因となっていることが強く示唆された。本件は現在論文作成中である。
本研究は直接的かつ迅速にVUSがpathogenicであるかbenignであるかを判定する系を構築し、遺伝性疾患におけるゲノム解析の結果をより有効に活用して遺伝性疾患の理解を拡げるものである。また、一つの遺伝子が複数の表現型の原因となる状態である多相遺伝 (pleiotropy)の概念は古くより提唱されていたが、遺伝性疾患における具体的な理解はまだ途上にある。本研究によるgenotype-phenotype連関の知見蓄積により、pleiotropyについての理解も深まることが期待できる。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

概ね研究は順調に進展している。申請時の研究計画に沿って進捗状況を示す。
1) 発達障害におけるVUSの収集と解析:前年度に引き続き、研究協力者である臨床遺伝専門医たちとの症例検討などから病的意義の明らかではないゲノムバリアント (VUS)の収集を継続している。今年度は、コレステロール代謝異常に起因する発達遅滞の原因遺伝子候補FDFT1のVUSなどを見出し、解析候補とした。
2) i-GONAD法を用いた遺伝子改変マウスの作出と評価:1)で収集されたVUSを正確に模したモデルマウス作製については、現在までに14遺伝子16系統のマウスの作出に成功した。一部マウスは戻し交配を行い、蛋白・細胞・神経病理の評価ならびに行動解析を施行している。昨年度より解析を継続していたてんかん・発達遅滞を呈する家系例に見出されたTENM4におけるスプライシング領域のVUSは、本VUSを正確に模したモデルマウスの解析により、薬剤誘発の痙攣に対する有意な感受性増加、脳梁の菲薄化など、病態を説明し得る表現型の異常を生体レベルならびに組織レベルの両方で明らかにすることができた。現在論文作成中である。また、同様に、自閉傾向を伴う発達遅滞症例に見られたCTNND2の挿入変異についてもマウスモデルの作製並びに解析を行ったところ、著明な活動性低下という発端症例に類似する表現型を呈した。本例についても病態との関連探索を継続している。
3) CRISPR/Cas9を用いたモデル細胞作製:Mowat-Wilson症候群の原因遺伝子であるZEB2の制御・被制御因子を探索する目的で、ゲノム編集による神経芽細胞腫セルラインのZEB2ノックアウト株を作製し、解析を継続している。また、ZEB2に良好な抗体がないことを受け、i-GONAD法を用いてZeb2にHAタグを接続したマウスモデルを作製し、ZEB2制御因子の探索に用いている。

今後の研究の推進方策

研究最終年度である前年度は、先行して得られたモデルマウスの表現型評価を概ね計画通りに進行することができた。論文の完成に至っていないため、延長期間である今年度は論文の完成を目標に、適宜必要な追加実験などを行う。
具体的に論文化が進んでいるTenm4のVUSを有するモデルマウスについては、現在脳梁菲薄化を来す組織学的検討を行っており、本データを加えて論文完成とする予定である。また、同様に論文化が進んでいるCtnnd2については、著明な活動性の低下を説明するための神経組織学的探索を行っており、その結果に応じて論文完成とする予定である。
その他、i-GONAD法で作成した数系統のマウスの表現型解析を適宜進行させ、これらについても論文化を目指す。また、本研究で得られた新規のgenotype-phenotype連関は発達遅滞における多相遺伝的な状態を理解するエビデンスとなることから、論文化の他にも公的データベースへの登録などを通じ、新規病態の周知に努め、未診断例への寄与を目指す。

報告書

(3件)
  • 2023 実施状況報告書
  • 2022 実施状況報告書
  • 2021 実施状況報告書
  • 研究成果

    (8件)

すべて 2023 2022

すべて 雑誌論文 (1件) (うち国際共著 1件、 査読あり 1件、 オープンアクセス 1件) 学会発表 (7件) (うち国際学会 4件)

  • [雑誌論文] Pathogenicity evaluation of variants of uncertain significance at exon-intron junction by splicing assay in patients with Mowat?Wilson syndrome2023

    • 著者名/発表者名
      Suzuki Yasuyo、Nomura Noriko、Yamada Kenichiro、Yamada Yasukazu、Fukuda Ayumi、Hoshino Kyoko、Abe Shinpei、Kurosawa Kenji、Inaba Mie、Mizuno Seiji、Wakamatsu Nobuaki、Hayashi Shin
    • 雑誌名

      European Journal of Medical Genetics

      巻: 66 号: 12 ページ: 104882-104882

    • DOI

      10.1016/j.ejmg.2023.104882

    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
    • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
  • [学会発表] Rapid generation of transgenic mouse mimicking variant of uncertain significance (VUS) clarifies its pathogenicity.2023

    • 著者名/発表者名
      Hayashi S, Suzuki Y, Fukushi D, Yamada K, Miyahara H
    • 学会等名
      The American Society of Human Genetics annual meeting 2023
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
    • 国際学会
  • [学会発表] Rapid generation of transgenic mouse mimicking variant of uncertain significance (VUS) clarifies its pathogenicity.2023

    • 著者名/発表者名
      Hayashi S, Suzuki Y, Fukushi D, Yamada K, Miyahara H.
    • 学会等名
      68th Annual Meeting of the Japan Society of Human Genetics/Human Genome Asia 2023
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
    • 国際学会
  • [学会発表] Analysis of variant of uncertain significance (VUS) in genetic disorder by rapid generation of transgenic mice by iGONAD.2023

    • 著者名/発表者名
      Suzuki Y, Fukushi D, Yamada K, Miyahara H, Hayashi S.
    • 学会等名
      The European Society of Human Genetics 2023 meeting
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
    • 国際学会
  • [学会発表] iGONAD法を用いた正確かつ迅速なモデルマウスの作製による遺伝性疾患における臨床的意義不明なゲノムバリアント (VUS)の病態理解.2023

    • 著者名/発表者名
      林深, 鈴木康予, 福士大輔, 山田憲一郎, 宮原弘明.
    • 学会等名
      第46回日本分子生物学会年会
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
  • [学会発表] ゲノム編集を用いたモデルマウス作出により知的障害に見出される臨床的意義の不明なゲノムバリアント (VUS)を解釈する.2023

    • 著者名/発表者名
      林深,鈴木 康予,古川 祐子,福士 大輔,山田 憲一郎,宮原 弘明.
    • 学会等名
      第58回中部日本小児科学会
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
  • [学会発表] Analysis of variant of uncertain significance (VUS) in genetic disorder by rapid generation of transgenic mice by iGONAD2023

    • 著者名/発表者名
      Shin Hayashi, Yasuyo Suzuki, Kimiko Kato, Daisuke Fukushi, Kenichiro Yamada
    • 学会等名
      The 67th European Human Genetics Conference
    • 関連する報告書
      2022 実施状況報告書
    • 国際学会
  • [学会発表] Analysis of variant of uncertain significance (VUS) in genetic disorder by rapid generation of transgenic mice by iGONAD.2022

    • 著者名/発表者名
      林 深, 鈴木康予, 加藤君子, 山田憲一郎
    • 学会等名
      日本人類遺伝学会第67回大会
    • 関連する報告書
      2022 実施状況報告書

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公開日: 2021-04-28   更新日: 2024-12-25  

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