C型肝炎ウイルスおよび新型コロナウイルス複製に必要な膜小胞の形成メカニズムの解析

• 研究課題/領域番号: 21K07974
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 基金
• 応募区分: 一般
• 審査区分: 小区分53010:消化器内科学関連
• 研究機関: 国立感染症研究所
• 研究代表者: 相崎 英樹 国立感染症研究所, ウイルス第二部, 室長 (00333360)
• 研究期間 (年度): 2021-04-01 – 2025-03-31
• 研究課題ステータス: 交付 (2023年度)
• 配分額: 4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円); 2023年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円); 2022年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円); 2021年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
• キーワード: C型肝炎ウイルス / 新型コロナウイル / doble membrane vesicle / NS5A / サブゲノミックレプリコン / HSD11 / HSD13 / 新型コロナウイルス / プラス鎖RNAウイルス / 複製 / double membrane vesicle

研究開始時の研究の概要

プラス鎖RNAウイルスはDMVを形成し、その中で複製していることが知られている。本研究の目的は、HCVをモデルとして、DMV形成に関与する宿主因子を見い出し、DMV形成のメカニズムを明らかにすることである。HCVのDMV形成についてはNS5AがDMV形成に必須なことが知られていることから、NS5A膜結合タンパクのHCV複製メカニズムを解明することを目的にしている。本研究はDMVで複製するSARS-CoV-2にも共通な治療の標的となるものと期待できる。閉じた膜系は細胞の生命活動の特徴であり、膜の生物学の研究に新らたな知見を提供できる可能性があり、学術的・実用的両面で価値の高い研究と考えられる。

研究実績の概要

本研究の目的は、C型肝炎ウイルス(HCV)をモデルとして、doble membrane vesicles (DMV)形成のメカニズムを明らかにすることである。HCVのDMV形成については、NS5AがDMV形成に必須なことが知られている。そこで、サブゲノミックレプリコンを導入したHuh7細胞を用いて、NS5Aタンパクで免疫沈降反応を行い、プロテオーム解析を行ったところ、NS5A結合タンパクとして11β-Hydroxysteroid dehydrogenase (HSD11)を見出した。さらに、HCVは脂肪滴周辺膜で粒子形成していることが知られているため、脂肪滴周辺膜を粗精製し、比較プロテオーム解析を行ったところ、HSD11を見出した。興味深いことに、HSD11はウイルス粒子産生に関与していることが考えられた。HSD11と近い構造を持ち、機能も類似しているタンパクとしてHSD13が存在する。HSD11および13のHCV生活環、特に複製および粒子形成における役割を解析している。
SARS-CoV-2もHCVと同じRNAウイルスで、細胞内でDMVを形成し、そこで複製をしている。最近、トランスポゾンの逆転写酵素活性により、新型コロナウイルス(SARS-CoV-2)遺伝子の一部が逆転写され、宿主細胞遺伝子に組み込まれる可能性が報告された。本研究ではSARS-CoV-2に感染したVero細胞及び腸管オルガノイドからRNAおよびDNAを抽出し、細胞内におけるSARS-CoV-2の存在様式について解析を目指している。さらに、次世代シークエンサーを用いて遺伝子発現解析を行っている。また、COVID-19罹患後の大腸検体を用いた解析でも、RNAとDNAの両方が増幅されていることが明らかになり、SARS-CoV-2が逆転写される可能性が示唆されている。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

HSD11とHCV粒子形成の関連性を調べるため、HSD11の脂肪滴局在シグナル欠損、酵素活性欠損など14種類の各種deletion mutantプラスミドを作成した。その後、レンチウイルスを用いて、野生型HSD11を含めて、HSD11欠損株に戻した細胞株を作成し、GFPの発現により、レンチウイルスでのHSD11およびそれら変異体の導入を確認し、それぞれの機能がHCVの生活環にどのように関わっているか検討した。オレイン酸、またはHCV感染で脂肪滴合成を亢進させたHuh7細胞にHSD11 siRNA、または脂肪滴局在シグナル欠損HSD11を導入したところ、 細胞内のLDの大きさおよび数が減少した。一方、野生型HSD11を発現させたところ、LDの数、大きさが増加した。さらに、野生型HSD11の発現によりHCV粒子産生の増加がみられたが、脂肪滴局在シグナル欠損HSD11ではHCV粒子産生が減少したことから、HSD11の脂肪滴局在性がHCV粒子産生に重要な役割を果たしている可能性が示唆された。
感染Vero細胞からRNA、DNAを抽出し、SARS-CoV-2の全長を網羅的に増幅させる約１００種類のプライマーを用いて増幅し、イルミナシークエンサーでシークエンスを行なった。得られたリードをヒトゲノムにマッピングし、マップされなかったリードをSARS-CoV-2にマッピングするという手法で解析したところ、RNAではほぼゲノム全長にわたって増幅されており、一方でDNAでも増幅箇所があることが明らかになった。COVID-19罹患後の患者の大腸検体を用いて同様の解析を行ったところ、増幅箇所に規則性や共通性はないが、RNA、DNAともにランダムに増幅されていることが示された。これらのことはSARS-CoV-2が逆転写されている可能性を示唆している。

今後の研究の推進方策

HCV粒子形成におけるHSD11の役割として、酵素としての活性、脂肪滴周辺膜への結合タンパクの輸送作用が想定された。当初、HSD11がウイルス粒子産生に重要な役割を持つことを示したが、HSD11は多くの臓器に広く分布している。一方、HSD11と近い構造を持ち、機能も類似しているHSD13は肝細胞に主に存在しているため、肝臓での病態に関与している可能性が考えられる。実際、HSD13は肝臓の線維化に関与していることが報告されている。そこで、HSD13とHCV粒子形成の関連性についても解析を始めた。HSD13欠損細胞を作成し、そこに酵素活性欠損、脂肪滴局在シグナル欠損等の各種HSD13の欠損体を発現させることにより、それぞれの機能がHCVの生活環、特に粒子形成にどのように関わっているか検討する。
マウスに経鼻的にSARS-CoV-2を肺に接種し、継時的に肺、肝臓、腸管を切除し、感染組織からRNAおよびDNAを抽出し、細胞内におけるSARS-CoV-2の存在様式について、まずqRT-PCRおよびqPCRで同定するとともに、次世代シークエンサーを用いて遺伝子発現解析を行なう。

研究成果

• [雑誌論文] Hepatocellular organellar abnormalities following elimination of hepatitis C virus (2023)
  • 著者名/発表者名: Aoyagi H, Iijima H, Gaber ES, Zaitsu T, Matsuda M, Wakae K, Watashi K, Suzuki R, Masaki T, Kahn J, Saito T, El-Kassas M, Shimada N, Kato K, Enomoto M, Hayashi K, Tsubota A, Mimata A, Sakamaki Y, Ichinose S, Muramatsu M, Wake K, Wakita T, Aizaki H
  • 雑誌名: Liver International 巻: 43 号: 8 ページ: 1677-1690
  • DOI: 10.1111/liv.15624
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Patient-derived monoclonal antibody neutralizes HCV infection in vitro and vivo without generating escape mutants (2022)
  • 著者名/発表者名: Yokokawa Hiroshi、Shinohara Midori、Teraoka Yuji、Imamura Michio、Nakamura Noriko、Watanabe Noriyuki、Date Tomoko、Aizaki Hideki、Iwamura Tomokatsu、Narumi Hideki、Chayama Kazuaki、Wakita Takaji
  • 雑誌名: PLOS ONE 巻: 17 号: 9 ページ: e0274283-e0274283
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0274283
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Independent evolution of multi-dominant viral genome species observed in a hepatitis C virus carrier (2022)
  • 著者名/発表者名: Ando Tomomi、Aizaki Hideki、Sugiyama Masaya、Date Tomoko、Hayashi Kazuhiko、Ishigami Masatoshi、Katano Yoshiaki、Goto Hidemi、Mizokami Masashi、Muramatsu Masamichi、Kuroda Makoto、Wakita Takaji
  • 雑誌名: Biochemistry and Biophysics Reports 巻: 32 ページ: 101327-101327
  • DOI: 10.1016/j.bbrep.2022.101327
  • 査読あり
• [雑誌論文] Development and Use of a Kinetical and Real-Time Monitoring System to Analyze the Replication of Hepatitis C Virus (2022)
  • 著者名/発表者名: Xiaoyu Li, Masahiko Ito, Haruyo Aoyagi, Asako Murayama, Hideki Aizaki, Masayoshi Fukasawa, Takanobu Kato, Takaji Wakita, Tetsuro Suzuki
  • 雑誌名: Int J Mol Sci 巻: 23 号: 15 ページ: 8711-8711
  • DOI: 10.3390/ijms23158711
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Induction of neutralizing antibodies against hepatitis C virus by a subviral particle-based DNA vaccine (2022)
  • 著者名/発表者名: Yato Keigo、Matsuda Mami、Watanabe Noriyuki、Watashi Koichi、Aizaki Hideki、Kato Takanobu、Tamura Koji、Wakita Takaji、Muramatsu Masamichi、Suzuki Ryosuke
  • 雑誌名: Antiviral Research 巻: 199 ページ: 105266-105266
  • DOI: 10.1016/j.antiviral.2022.105266
  • 査読あり
• [雑誌論文] Development of an intervention system for linkage-to-care and follow-up for hepatitis B and C virus carriers (2021)
  • 著者名/発表者名: Kikuchi Minami、Sawabe Motoji、Aoyagi Haruyo、Wakae Kosho、Watashi Koichi、Hattori Satoru、Kawabe Naoto、Yoshioka Kentaro、Tanaka Junko、Muramatsu Masamichi、Wakita Takaji、Aizaki Hideki
  • 雑誌名: Hepatology International 巻: 16 号: 1 ページ: 68-80
  • DOI: 10.1007/s12072-021-10269-5
  • 査読あり
• [雑誌論文] Interferon-gamma induced APOBEC3B contributes to Merkel cell polyomavirus genome mutagenesis in Merkel cell carcinoma (2021)
  • 著者名/発表者名: Que L, Li Y, Dainichi T, Kukimoto I, Nishiyama T, Nakano Y, Shima K, Suzuki T, Sato Y, Horike S, Aizaki H, Watashi K, Kato T, Aly HH, Watanabe N, Kabashima K, Wakae K, Muramatsu M.
  • 雑誌名: J Invest Dermatol 巻: S0022-202X(21) 号: 7 ページ: 02636-1
  • DOI: 10.1016/j.jid.2021.12.019
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Prolonged Gut Dysbiosis and Fecal Excretion of Hepatitis A Virus in Patients Infected with Human Immunodeficiency Virus. (2021)
  • 著者名/発表者名: Ishizaka A, Koga M, Mizutani T, Lim LA, Adachi E, Ikeuchi K, Ueda R, Aoyagi H, Tanaka S, Kiyono H, Matano T, Aizaki H, Yoshio S, Mita E, Muramatsu M, Kanto T, Tsutsumi T, Yotsuyanagi H
  • 雑誌名: Viruses. 巻: 13 号: 10 ページ: 2101-2101
  • DOI: 10.3390/v13102101
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] NTCP Oligomerization Occurs Downstream of the NTCP-EGFR Interaction during Hepatitis B Virus Internalization (2021)
  • 著者名/発表者名: Fukano Kento、Oshima Mizuki、Tsukuda Senko、Aizaki Hideki、Ohki Mio、Park Sam-Yong、Wakita Takaji、Wakae Kousho、Watashi Koichi、Muramatsu Masamichi
  • 雑誌名: Journal of Virology 巻: 95 号: 24 ページ: 1-12
  • DOI: 10.1128/jvi.00938-21
  • 査読あり
• [雑誌論文] Cellular OCIAD2 protein is a proviral factor for hepatitis C virus replication. (2021)
  • 著者名/発表者名: Yang Z, Ouyang T, Aoyagi H, Wang T, Xing X, Zhang Y, Wang Y, Li Y, Aizaki H, Li S, Kong L
  • 雑誌名: Int J Biol Macromol. 巻: 188 ページ: 147-159
  • DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2021.08.032
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Identification of natural compounds extracted from crude drugs as novel inhibitors of hepatitis C virus (2021)
  • 著者名/発表者名: Zheng Xin、Guo Rui、Liu Qingbo、Wakae Kousho、Watanabe Noriyuki、Fukano Kento、Que Lusheng、Li Yingfang、Aly Hussein H.、Watashi Koichi、Suzuki Ryosuke、Murayama Asako、Kato Takanobu、Aizaki Hideki、Wakita Takaji、Huang Xiaoxiao、Yan Yi、Song Shao-Jiang、Muramatsu Masamichi
  • 雑誌名: Biochemical and Biophysical Research Communications 巻: 567 ページ: 1-8
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2021.06.022
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Oncogenic transcriptomic profile is sustained in the liver after the eradication of the hepatitis C virus (2021)
  • 著者名/発表者名: Takeda Haruhiko、Takai Atsushi、Iguchi Eriko、Mishima Masako、Arasawa Soichi、Kumagai Ken、Eso Yuji、Shimizu Takahiro、Takahashi Ken、Ueda Yoshihide、Taura Kojiro、Hatano Etsuro、Iijima Hiroko、Aoyagi Haruyo、Aizaki Hideki、Marusawa Hiroyuki、Wakita Takaji、Seno Hiroshi
  • 雑誌名: Carcinogenesis 巻: 42 号: 5 ページ: 672-684
  • DOI: 10.1093/carcin/bgab014
  • 査読あり
• [学会発表] Hepatocellular organelle and gene expression abnormalities following elimination of hepatitis C virus and carcinogenesis. (2023)
  • 著者名/発表者名: Haruyo Aoyagi, Hiroko Iijima, Koichi Watashi, Ryosuke Suzuk, Takahiro Masaki, Noritomo Shimada, Keizo Kato, Akihito Tsubota, Yuriko Sakamaki, Shizuko Ichinose, Kenjiro Wake, Masaya Sugiyama, Masashi Mizokami, Takaji Wakita, Hideki Aizaki.
  • 学会等名: 第3回 International Liver Conference 2023. 東京
  • 国際学会
• [学会発表] Hepatocellular organelle and gene expression abnormalities following. (2023)
  • 著者名/発表者名: Aoyagi H, Iijima H, Kikuchi M, Gewaid HE, Matsuda M, Watashi K, Suzuki R, Masaki T, Shimada N, Kato K, Tsubota A, Mimata A, Sakamaki Y, Ichinose S, Muramatsu M, Wake K, Sugiyama M, Mizokami M, Wakita T, Aizaki H.
  • 学会等名: 29th International Symposium on Hepatitis C Virus and Related Viruses. Atlanta.
  • 国際学会
• [学会発表] C型肝炎ウイルス除去後のオルガネラ異常. (2023)
  • 著者名/発表者名: 青柳東代、飯島尋子、松田麻未、若江亨祥、渡士幸一、鈴木亮介、政木隆博、杉山真也、坪田昭人、島田紀朋、加藤慶三、林和彦、榎本大、三又絢子、酒巻有里子、市野瀬志津子、村松正道、溝上雅史、和氣健二郎、脇田隆字、相崎英樹.
  • 学会等名: 第６９回日本ウイルス学会学術集会
• [学会発表] RHV RNA複製の高いcured細胞の樹立とその評価 (2023)
  • 著者名/発表者名: 園部円、渡邉則幸、鈴木貴也、小柳円、有村裕、相崎英樹、村松正道、脇田隆字
  • 学会等名: 第69回日本ウイルス学会学術集会
• [学会発表] ラット肝炎ウイルス感染動物モデルを用いたC型肝炎ウイルスワクチン開発 (2023)
  • 著者名/発表者名: 渡邉則幸、園部円、鈴木貴也、李天成、須崎百合子、網康至、花木賢一、小柳円、有村裕、鈴木亮介、相崎英樹、村松正道、脇田隆字
  • 学会等名: 第26回日本ワクチン学会学術集会
• [学会発表] Hepatocellular organellar abnormalities following elimination of hepatitis C virus (2022)
  • 著者名/発表者名: Haruyo Aoyagi, Hiroko Iijima, Minami Kikuchi, Mami Matsuda, Koichi Watashi, Ryosuke Suzuki, Takahiro Masaki, Noritomo Shimada, Keizo Kato, Akihito Tsubota, Ayako Mimata, Yuriko Sakamaki, Shizuko Ichinose, Masamichi Muramatsu, Kenjiro Wake, Masaya Sugiyama, Masashi Mizokami, Takaji Wakita, Hideki Aizaki.
  • 学会等名: 28th International Symposium on Hepatitis C Virus, Flaviviruses, and Related Viruses
  • 国際学会
• [学会発表] C型肝炎ウイルス除去後のオルガネラ異常 (2022)
  • 著者名/発表者名: 青柳東代、飯島尋子、松田麻未、若江亨祥、渡士幸一、鈴木亮介、政木隆博、杉山真也、坪田昭人、島田紀朋、加藤慶三、林和彦、榎本大、三又絢子、酒巻有里子、市野瀬志津子、村松正道、溝上雅史、和氣健二郎、脇田隆字、相崎英樹
  • 学会等名: 第６９回日本ウイルス学会学術集会
• [学会発表] RHV RNA複製の高いcured細胞の樹立とその評価 (2022)
  • 著者名/発表者名: 園部円、渡邉則幸、鈴木貴也、小柳円、有村裕、相崎英樹、村松正道、脇田隆字
  • 学会等名: 第69回日本ウイルス学会学術集会
• [学会発表] ラット肝炎ウイルス感染動物モデルを用いたC型肝炎ウイルスワクチン開発 (2022)
  • 著者名/発表者名: 渡邉則幸、園部円、鈴木貴也、李天成、須崎百合子、網康至、花木賢一、小柳円、有村裕、鈴木亮介、相崎英樹、村松正道、脇田隆字
  • 学会等名: 第26回日本ワクチン学会学術集会
• [学会発表] Development of a community-based intervention system for linkage to care and follow-up for hepatitis virus-positive individuals cooperating with health care providers (2021)
  • 著者名/発表者名: Minami Kikuchi, Haruyo Aoyagi, Kosho Wakae, Koichi Watashi, Satoru Hattori, Naoto Kawabe, Kentaro Yoshioka, Junko Tanaka, Masamichi Muramatsu, Takaji Wakita, Motoji Sawabe, Hideki Aizaki
  • 学会等名: Global Heapatitis Summit, The 17th International Symposium on Viral Hepatitis and Liver Disease
  • 国際学会
• [学会発表] Abnormal hepatocellular organelles in patients with sustained virological response (2021)
  • 著者名/発表者名: Haruyo Aoyagi, Hiroko Iijima Minami Kikuchi, Mami Matsuda, Koichi Watashi, Ryosuke Suzuki, Takahiro Masaki, Noritomo Shimada, Keizo Kato, Akihito Tsubota, Takeya Tsutsumi, Kazuya Okushin, Kyoji Moriya, Kazuhiko Koike, Masamichi Muramatsu, Kenjiro Wake, Takaji Wakita, Hideki Aizaki
  • 学会等名: The 21th International Symposium on Hepatitis C Virus and Related Viruses
  • 国際学会
• [学会発表] NTCP oligomerization is initiated downstream of the NTCP-EGFR interaction during HBV internalization (2021)
  • 著者名/発表者名: Kento Fukano, Mizuki Oshima, Senko Tsukuda, Hideki Aizaki, Mio Ohki, Sam-Yong Park, Takaji Wakita, Kousho Wakae, Koichi Watashi, Masamichi Muramatsu
  • 学会等名: International HBV meeting
  • 国際学会
• [学会発表] SLC10A1/NTCP多量体形成が制御するB型肝炎ウイルス細胞内侵入機構の解析 (2021)
  • 著者名/発表者名: 深野顕人, 大嶋美月, 九十田千子, 相崎英樹, 大木規央, 朴三用, 脇田隆字, 若江亨祥, 渡士幸一, 村松正道
  • 学会等名: 第94回日本生化学大会
• [学会発表] 新規の作用によりB型肝炎ウイルス感染を阻害する酸化ステロール合成誘導体の同定 (2021)
  • 著者名/発表者名: 大嶋美月, 深野顕人, 岩本将士, Frank Stappenbeck, Feng Wang, 鄭シン, 山崎雅子, 若江亨祥, 相崎英樹, 倉持幸司, 村松正道, 脇田隆字, Farhad Parhami, 渡士幸一
  • 学会等名: 日本薬学会第141年会
• [学会発表] 感染受容体NTCPの多量体化が導くB型肝炎ウイルス内在化機構の解明 (2021)
  • 著者名/発表者名: 深野顕人, 大嶋美月, 九十田千子, 相崎英樹, 大木規央, 朴三用, 脇田隆字, 若江亨祥, 渡士幸一, 村松正道
  • 学会等名: 日本薬学会第141年会
• [学会発表] 自治体と医療関係者が連携した肝炎ウイルスキャリアの動向調査および陽性者のフォローアップシステムによる行動変容の解析 (2021)
  • 著者名/発表者名: 菊池みなみ, 川部直人, 青柳東代, 服部悟, 若江亨祥, 渡士幸一, 吉岡健太郎, 佐竹正博, 是永匡昭, 田中純子, 村松正道, 脇田隆字, 沢辺元司, 相崎英樹
  • 学会等名: 第57回日本肝臓学会総会
• [学会発表] Identification of an oxysterol derivative that inhibits HBV infection by interrupting NTCP oligomerization (2021)
  • 著者名/発表者名: Oshima M, Fukano K, Iwamoto M, Stappenbeck F, Wang F, Wakae K, Aizaki H, Kuramochi K, Muramatsu M, Wakita T, Parhami F, Watashi K
  • 学会等名: 第68回日本ウイルス学会
• [学会発表] HIV陽性者におけるA型肝炎ウイルス罹患による急性炎症と腸内細菌叢の動態解析 (2021)
  • 著者名/発表者名: 石坂 彩、古賀 道子、水谷 壮利、林 阿英、安達 英輔、池内 和彦、上田 竜大、青柳 東代、清野 宏、俣野 哲朗、相崎 英樹、由雄 祥代、村松 正道、考藤 達哉、堤 武也、四柳 宏
  • 学会等名: 第35回日本エイズ学会学術集会
• [図書] ウイルス性肝炎発見の歴史、ウイルス性肝炎学2023―最新の病態・診断・治療― (2023)
  • 著者名/発表者名: 相崎英樹、溝上雅史、脇田隆字
  • 総ページ数: 5
  • 出版者: 日本臨床社、東京
• [図書] 日本の感染症―明らかにされたこと残された課題 (2022)
  • 著者名/発表者名: 相崎英樹
  • 総ページ数: 22
  • 出版者: 南山堂
• [図書] 臨床消化器内科Vol.37 No.9 (2022)
  • 著者名/発表者名: 相崎英樹、青柳東代、杉山真也、村松正道、溝上雅史、脇田隆字
  • 総ページ数: 6
  • 出版者: 日本メディカルセンター
• [図書] Ｃ型肝炎ウイルスの感染増殖と病原性発現メカニズム、創薬研究者がこれだけは知っておきたい最新のウイルス学 (2021)
  • 著者名/発表者名: 相崎英樹
  • 総ページ数: 9
  • 出版者: 技術情報協会
• [図書] C型肝炎のウイルス学と病態、C型肝疾患の今後の課題―肝炎、肝硬変、肝がん― (2021)
  • 著者名/発表者名: 青柳東代、村松正道、脇田隆字、相崎英樹
  • 総ページ数: 8
  • 出版者: 消化器内科
• [備考] 国立感染症研究所 ウイルス第二部 肝炎研究
  • URL: https://www.niid.go.jp/niid/ja/vir2-hv.html
• [備考] 相崎英樹、石井孝司、A型肝炎、お医者さんオンライン、プレシジョン、
  • URL: https://www.premedi.co.jp/%E3%81%8A%E5%8C%BB%E8%80%85%E3%81%95%E3%82%93%E3%82%AA%E3%83%B3%E3%83%A9%E3%82%A4%E3%83%B3/h00448