オルガノイドを用いた胃発がんモデルの確立と発がん機構の解明

• 研究課題/領域番号: 21K08019
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 基金
• 応募区分: 一般
• 審査区分: 小区分53010:消化器内科学関連
• 研究機関: 千葉県がんセンター(研究所)
• 研究代表者: 筆宝 義隆 千葉県がんセンター(研究所), 発がん制御研究部, 研究所長 (30359632)
• 研究分担者: 丸 喜明 千葉県がんセンター(研究所), 発がん研究グループ 発がん制御研究部, 研究員 (30742754)
• 研究期間 (年度): 2021-04-01 – 2024-03-31
• 研究課題ステータス: 交付 (2022年度)
• 配分額: 4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円); 2023年度: 1,040千円 (直接経費: 800千円、間接経費: 240千円); 2022年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円); 2021年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
• キーワード: 胃がん / オルガノイド / 発がん / マウス / 遺伝子変異

研究開始時の研究の概要

ゲノム解析の進展により胃がんの遺伝子異常の解明が進んだが、疾患モデルの作成は追いついておらず、発症機構の解明や前臨床モデルの確立には多くの課題が残されている。申請者はマウス正常オルガノイドへの遺伝子導入と免疫不全マウス皮下への接種を組み合わせた発がんモデルを複数の臓器に対して構築し,胃に関しても発がん誘導可能であることを確認済みである。本研究では多様な遺伝子異常の発がん性検証や化学発がんモデルとの統合を進める。遺伝子改変マウスとの比較により胃がんの病態がどの程度忠実に再現可能か検証し、他臓器の発がんモデルとの比較により発がんに重要な胃固有のエピジェネティックな要因を明らかにする。

研究実績の概要

これまでにマウス正常オルガノイドへの遺伝子導入と免疫不全マウス皮下への移植を組み合わせた、「オルガノイド発がんモデル」を複数の臓器に対して構築してきた。その過程で、当該臓器での主要遺伝子異常であっても単独で腫瘍形成に至るのは稀であり複数の異常の組み合わせが必要なこと、初代培養開始後2-3ヶ月程度で過去のin vivoモデルと概ね同等の結果が再現可能だが、一部で結果に乖離がみられ微小環境の重要性が示唆される場合があること、などを明らかにしてきた。マウス腺胃由来オルガノイドに関しても、高頻度な主要がん関連遺伝子異常を組み合わせて再現を行い、多様な組織像の腫瘍の誘導が基本的に可能であることを確認した。ただし、当初の想定よりも同一の遺伝子異常に対して得られる腫瘍の多様性および腫瘍内不均一性が高いことが判明したため、実験の件数を増やして傾向の把握に努めた。また、実験の各ステップのオルガノイドを採取することで発がん過程の詳細な解析が可能である利点を生かし、活性型Kras変異が単独では培養中に排除されることを明らかにした。これは膵管細胞とは同様の反応だが、腸管細胞とは逆の反応である。一方、p53欠失と組み合わせることで強い正の選択を受けるのはいずれの臓器でも同様であった。オルガノイド培養の実験条件が各臓器で全く同一であることを踏まえると、これらの結果は臓器ごとのエピジェネティックな状態によりKras変異単独での発がんにおける意義が異なることを示唆するものと考えられた。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

胃がんの主要遺伝子異常の組み合わせに対しては、オルガノイドを用いた発がん性の基礎的検討を完了した。他の臓器でのモデルにおける結果と同様に、免疫不全マウス皮下におけるオルガノイドと間質との相互作用が惹起するエピジェネティックな変化、およびその後のクローン選択が腫瘍形成に重要な役割を果たしていることを確認した。特に、皮下腫瘍由来のオルガノイドを再移植した場合、元々の遺伝子異常の組み合わせに関わらずその腫瘍原性が飽和してしまい区別がつかなくなることを見出した。そのため、通常のアッセイでは3遺伝子変異までの組み合わせに関する発がん性評価に限定してのみ利用可能であると結論づけた。化学物質と遺伝子異常による発がんの協調作用については、発がん性物質で単独では腫瘍形成を認めなかったことから、betaカテニンの蓄積にも関わらず嚢胞(100%)の誘導に留まるなど低い腫瘍原性を示すApcとp53の二重欠失（A5）オルガノイドを用いて遺伝毒性物質２種類を投与するアッセイを行った。その結果、１種類において充実性の腺がんが誘導され、一般的にin vivoでは発がん性が低いとされるマウス胃がんの化学発がんの簡便かつ迅速な実験系の確立につながる成果と考えられた。

今後の研究の推進方策

低い腫瘍原性を示すA5オルガノイドを用いることで化学発がんによる腫瘍形成が誘導された。当該腫瘍由来オルガノイドのゲノム解析を行うことで、Apcとp53の二重欠失と協調的に作用して発がんを誘導した遺伝子異常の同定を試みる。また、同様にA5オルガノイドにゲノムワイドshRNAライブラリーを導入してスクリーニングを行うことで、新規の胃がん抑制遺伝子の同定を目指す。p53欠失とCdh１発現抑制組み合わせ（C5）により腺癌が誘導された（100%）。CDH1変異陽性びまん型胃がんの特徴である印環細胞を一部の腫瘍に認めるなど、遺伝子改変マウスの結果を一部再現したが、基本的に腺管優位の腸型であり、びまん型の誘導には胃微小環境が重要であり、皮下組織では完全に代償できない可能性が示唆された。そこで、びまん型で高発現のIHHをC5オルガノイドに導入することでびまん性増殖がどこまで再現可能になるか検証する。さらに、これまでに得られた腫瘍由来オルガノイドに対する薬剤スクリーニングを行い、変異に特異的な新規治療薬の探索を行う。

研究成果

• [雑誌論文] Application of organoid culture from HPV18-positive small cell carcinoma of the uterine cervix for precision medicine (2023)
  • 著者名/発表者名: Kusakabe M, Taguchi A, Tanikawa M, Hoshi D, Tsuchimochi S, Qian X, Toyohara Y, Kawata A, Wagatsuma R, Yamaguchi K, Yamamoto Y, Ikemura M, Sone K, Mori-Uchino M, Matsunaga H, Tsuruga T, Nagamatsu T, Kukimoto I, Wada-Hiraike O, Kawazu M, Ushiku T, Takeyama H, Oda K, Kawana K, Hippo Y, Osuga Y.
  • 雑誌名: Cancer Med 巻: 12 号: 7 ページ: 8476-8489
  • DOI: 10.1002/cam4.5588
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Anticancer effect of a pyrrole‐imidazole polyamide‐triphenylphosphonium conjugate selectively targeting a common mitochondrial DNA cancer risk variant in cervical cancer cells (2022)
  • 著者名/発表者名: Yao Jihang、Takenaga Keizo、Koshikawa Nobuko、Kida Yuki、Lin Jason、Watanabe Takayoshi、Maru Yoshiaki、Hippo Yoshitaka、Yamamoto Seigi、Zhu Yuyan、Nagase Hiroki
  • 雑誌名: International Journal of Cancer 巻: 152 号: 5 ページ: 962-976
  • DOI: 10.1002/ijc.34319
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Derivation of pancreatic acinar cell carcinoma cell line HS‐1 as a patient‐derived tumor organoid (2022)
  • 著者名/発表者名: Hoshi Daisuke、Kita Emiri、Maru Yoshiaki、Kogashi Hiroyuki、Nakamura Yuki、Tatsumi Yasutoshi、Shimozato Osamu、Nakamura Kazuyoshi、Sudo Kentaro、Tsujimoto Akiko、Yokoyama Ryo、Kato Atsushi、Ushiku Tetsuo、Fukayama Masashi、Itami Makiko、Yamaguchi Taketo、Hippo Yoshitaka
  • 雑誌名: Cancer Science 巻: 114 号: 3 ページ: 1165-1179
  • DOI: 10.1111/cas.15656
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Editorial: Development of in vitro toxicology methods using organoid systems and toxicogenomic approaches (2022)
  • 著者名/発表者名: Imai Toshio、Hippo Yoshitaka
  • 雑誌名: Frontiers in Genetics 巻: 13
  • DOI: 10.3389/fgene.2022.1030580
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] The potential of organoids in toxicologic pathology: Histopathological and immunohistochemical evaluation of a mouse normal tissue-derived organoid-based carcinogenesis model (2022)
  • 著者名/発表者名: Ishigamori Rikako、Naruse Mie、Hirata Akihiro、Maru Yoshiaki、Hippo Yoshitaka、Imai Toshio
  • 雑誌名: Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ 巻: 35 号: 3 ページ: 211-223
  • DOI: 10.1293/tox.2022-0021
  • ISSN: 0914-9198, 1881-915X
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Two-Way Development of the Genetic Model for Endometrial Tumorigenesis in Mice: Current and Future Perspectives (2021)
  • 著者名/発表者名: Maru Yoshiaki、Hippo Yoshitaka
  • 雑誌名: Frontiers in Genetics 巻: 12 ページ: 798628-798628
  • DOI: 10.3389/fgene.2021.798628
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Twists and turns in Kras-driven tumor initiation (2021)
  • 著者名/発表者名: Maru Yoshiaki、Hippo Yoshitaka
  • 雑誌名: Aging 巻: 13 号: 22 ページ: 24477-24479
  • DOI: 10.18632/aging.203726
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Single-cell DNA and RNA sequencing reveals the dynamics of intra-tumor heterogeneity in a colorectal cancer model. (2021)
  • 著者名/発表者名: Ono H, Arai Y, Furukawa E, Narushima D, Matsuura T, Nakamura H, Shiokawa D, Nagai M, Imai T, Mimori K, Okamoto K, Hippo Y, Shibata T, Kato M.
  • 雑誌名: BMC Biol 巻: 19(1) 号: 1 ページ: 207-207
  • DOI: 10.1186/s12915-021-01147-5
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Probing the tumorigenic potential of genetic interactions reconstituted in murine fallopian tube organoids (2021)
  • 著者名/発表者名: Maru Yoshiaki、Tanaka Naotake、Tatsumi Yasutoshi、Nakamura Yuki、Yao Ryoji、Noda Tetsuo、Itami Makiko、Hippo Yoshitaka
  • 雑誌名: The Journal of Pathology 巻: 255 号: 2 ページ: 177-189
  • DOI: 10.1002/path.5752
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Kras activation in endometrial organoids drives cellular transformation and epithelial-mesenchymal transition (2021)
  • 著者名/発表者名: Maru Yoshiaki、Tanaka Naotake、Tatsumi Yasutoshi、Nakamura Yuki、Itami Makiko、Hippo Yoshitaka
  • 雑誌名: Oncogenesis 巻: 10 号: 6 ページ: 46-46
  • DOI: 10.1038/s41389-021-00337-8
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Recent Advances in Implantation-Based Genetic Modeling of Biliary Carcinogenesis in Mice (2021)
  • 著者名/発表者名: Izumiya Masashi、Kato Shingo、Hippo Yoshitaka
  • 雑誌名: Cancers 巻: 13 号: 10 ページ: 2292-2292
  • DOI: 10.3390/cancers13102292
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Precision modeling of gall bladder cancer patients in mice based on orthotopic implantation of organoid-derived tumor buds (2021)
  • 著者名/発表者名: Kato Shingo、Fushimi Kentaro、Yabuki Yuichiro、Maru Yoshiaki、Hasegawa Sho、Matsuura Tetsuya、Kurotaki Daisuke、Suzuki Akihiro、Kobayashi Noritoshi、Yoneda Masato、Higurashi Takuma、Enaka Makiko、Tamura Tomohiko、Hippo Yoshitaka、Nakajima Atsushi
  • 雑誌名: Oncogenesis 巻: 10 号: 4 ページ: 30-30
  • DOI: 10.1038/s41389-021-00322-1
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] マウスオルガノイド大腸発癌モデルを用いた薬剤スクリーニング (2022)
  • 著者名/発表者名: 落合 頼業、泉谷 昌志、星 大輔、古樫 浩之、筆宝 義隆
  • 学会等名: 第81回日本癌学会学術総会
• [学会発表] Organoid-based hybrid carcinogenesis model to probe pro-tumorigenic genetic interactions in endometrium (2022)
  • 著者名/発表者名: 丸喜明、筆宝義隆
  • 学会等名: 第81回日本癌学会学術総会
• [学会発表] オルガノイド培養技術のがん予防研究への導入に向けて (2022)
  • 著者名/発表者名: 丸喜明、筆宝義隆
  • 学会等名: がん予防学術大会2022 KYOTO
  • 招待講演
• [学会発表] 子宮内膜正常オルガノイドを用いた発がんおよび転移モデルの確立 (2022)
  • 著者名/発表者名: 丸喜明、筆宝義隆
  • 学会等名: 第31回日本がん転移学会学術集会・総会
  • 招待講演
• [学会発表] Translational research in gynecologic cancer using organoid culture technique (2022)
  • 著者名/発表者名: 丸喜明
  • 学会等名: 第81回日本癌学会学術総会
  • 招待講演
• [学会発表] がん特異的遺伝子異常を再構成したマウスオルガノイドによる発がん協調作用の検出 (2021)
  • 著者名/発表者名: 筆宝義隆
  • 学会等名: 第39回ヒト細胞学会
  • 招待講演
• [学会発表] Banking of patient-derived gynecologic cancer organoids toward implementation of precision medicine. (2021)
  • 著者名/発表者名: Yoshiaki Maru, Yoshitaka Hippo
  • 学会等名: 1ST JCA-AACR PRECISION CANCER MEDICINE INTERNATIONAL CONFERENCE
  • 国際学会