| 研究課題/領域番号 |
21K08100
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分53020:循環器内科学関連
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| 研究機関 | 信州大学 |
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研究代表者 |
門田 真 信州大学, 学術研究院医学系, 講師 (70799064)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
完了 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)
2023年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
2022年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2021年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
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| キーワード | HCN4 / ペースメーカー細胞 / 心筋成熟化 / 多能性幹細胞 / セルソーティング / 自動能 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
HCN4陽性ペースメーカー細胞とHCN4陽性非ペースメーカー細胞を細胞膜電位・細胞内Ca2+濃度変動波形から判別し、それぞれから局所的に微量RNAを採取してRNAシーケンス(RNA-seq)解析を行い、ペースメーカー細胞分化・自動能維持に関わる遺伝子群を特定する。その上で、特定された複数の遺伝子を標識するヒトiPS細胞株を樹立し、薬剤選択などによりペースメーカー細胞を純化する。さらに、純化ペースメーカー細胞のラット心臓への移植実験を行い、長期的なペーシング機能を評価する。
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| 研究実績の概要 |
ペースメーカー細胞を標識するためにヒトiPS細胞のHCN4遺伝子下流にtdTomato遺伝子を導入したHCN4レポーター遺伝子細胞株を樹立し、さらに別のペースメーカー細胞特異的な遺伝子下流にも蛍光レポーター遺伝子を導入したが、ペースメーカー細胞の誘導効率が低いためか蛍光発現が一定でなかったため、HCN4の発現と心筋細胞成熟化の関連について研究した。
HCN4レポーター遺伝子導入ヒトiPS細胞から心筋細胞を分化誘導し、長期培養と成熟プロトコルを組み合わせて心筋細胞の成熟化を試みた。実験に用いた心筋細胞は、通常培養で40日と60日間、成熟プロトコルで40日とその後60日まで長期培養して作製した。これら4群に対してHCN4の発現を評価し、心筋細胞の成熟度との相関を比較検討した。
フローサイトメトリーや蛍光顕微鏡によるレポーター蛋白の発現解析とRNA発現解析及び電気生理学的解析において、通常培養(40日間)に対して長期培養や成熟プロトコルを用いることでHCN4の発現が減少し、心筋細胞の成熟度とHCN4発現は逆相関した。一方、細胞サイズやRNAの成熟マーカーの発現から最も成熟したのは成熟プロトコルで長期培養した心筋細胞であった。しかし、長期培養と成熟プロトコルそれぞれ単独と比較して、両方を組み合わせても、HCN4の発現を減少させる相乗効果はなかった。
以上の結果から、多能性幹細胞由来心筋細胞におけるHCN4発現低下には、心筋成熟のみならず、心筋成熟以外の因子が関与していることが示唆された。
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