EGFR遺伝子変異の代謝特性に基づく治療抵抗性の克服

• 研究課題/領域番号: 21K08191
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 基金
• 応募区分: 一般
• 審査区分: 小区分53030:呼吸器内科学関連
• 研究機関: 川崎医科大学
• 研究代表者: 瀧川 奈義夫 川崎医科大学, 医学部, 教授 (60325107)
• 研究分担者: 越智 宣昭 川崎医科大学, 医学部, 講師 (80611615) ; 山根 弘路 川崎医科大学, 医学部, 准教授 (50624897) ; 中西 秀和 川崎医科大学, 医学部, 准教授 (50309548)
• 研究期間 (年度): 2021-04-01 – 2024-03-31
• 研究課題ステータス: 交付 (2022年度)
• 配分額: 4,030千円 (直接経費: 3,100千円、間接経費: 930千円); 2023年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円); 2022年度: 1,040千円 (直接経費: 800千円、間接経費: 240千円); 2021年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
• キーワード: EGFR / プロテオーム / メタボローム / トランスクリプトーム / 肺癌

研究開始時の研究の概要

種々のEGFR遺伝子変異を有する細胞を用いて変異別の代謝経路を同定する。次に、EGFR-TKI感受性細胞と耐性細胞のシングルセル解析を行い、メタボローム解析結果を統合し耐性を誘導する代謝酵素や代謝産物を同定する。最後に、それらを阻害する薬剤を用いてin vitroとin vivoにおける有効性を評価する。

研究実績の概要

マウスpro-B細胞株（Ba/F3）に、EGFR野生型、EGFRエクソン19欠失、エクソン21 L858R遺伝子変異を導入した細胞株（WT、19Del、L858R）を、プロテオミクス、トランスクリプトミクス、およびメタボロミクスのマルチオミクス解析を用いて比較した。
19Del細胞もL858R細胞もEGFRチロシンキナーゼ阻害薬（TKI)のゲフィチニブ、アファチニブ、オシメルチニブの感受性はWT細胞に比べて、500～9000倍の高い感受性を示した。
プロテオーム解析により、L858R細胞ではプラスチン2、TKT、PDIA5、およびENO1の発現が増加し、19Del細胞ではEEF1Gの発現が増加していた。
RNAシーケンスでは、112の遺伝子が19Del細胞とL858R細胞の間で（70遺伝子がp<0.01、42遺伝子がp=0.01～0.05)と有意差が認められた。19Del細胞とL858R細胞で有意に上昇していたものはそれぞれ25遺伝子と87遺伝子であった。L858R細胞で1.5倍以上の変化があるものをクラスター解析をすると5つに分類され、Gene ontology解析ではクラスター1、2、3で、それぞれ113 terms、1338 terms、69 termsが有意に変化していた。
メタボローム分析では、アミノ酸、アデニル酸、グアニル酸、NADPH、乳酸、ピルビン酸グルコース6-リン酸、およびリボース5-リン酸が19Del細胞と L858R細胞の間で有意に異なることが示された。GSHがL858R細胞で増加していたため、L858R細胞でオシメルチニブとGSH阻害剤のBSOを併用したところ、相乗効果が認められた。
背景が均一なBa/F3細胞でもEGFR19DelとL858R変異を導入した細胞の表現型の複雑さが実証され、EGFR変異に特異的な治療戦略を検討する必要性があると考えられた。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

シングルセル解析を計画しているが、標的となる遺伝子をまずトランスクリプトーム解析で同定後、その結果に合わせて2024年に行う。その他の計画は順調である。

今後の研究の推進方策

クローニングしたオシメルチニブ高感受性のBa/F3細胞（del、L858R）をシングルセルにしてオシメルチニブに短期曝露（2週間）と長期曝露（2ヶ月、4ヶ月）を行う。それぞれ増殖してきた細胞を再度クローニングし、耐性細胞（del/Osm、L858R/Osm）を得る。また、エクソン19欠失肺腺癌細胞株（PC-9）のオシメルチニブ曝露による耐性株（PC-9/Osm）を作製し、これまで報告されていない耐性機序のものをクローニングする。
Chromiumシングルセルコントローラーを用いて、上記のオシメルチニブ感受性細胞と耐性細胞（T790Mの確認されているRPC-9細胞株を含む）のシングルセル解析を行う。
野生型と変異型の差はグルタチオン代謝経路に関係があることが予備実験で示されたため、各種変異株の還元型グルタチオン（GSH）、酸化型グルタチオン（GSSG）、グルタミン酸、システイン、グリシン濃度の差を比較する。delとL858Rの比較においては、プロテオーム解析で差が認められたペントースリン酸経路での鍵となる代謝産物の同定を行う。
システインからγグルタミルシステインへの変換を阻害するBSO、GSHを阻害するAPR-246、グルタミナーゼを阻害するCB-839、グルタミン酸輸送を阻害するTFB-TBOAを併用した際のEGFR-TKIの感受性を決定し、EGFR下流シグナルおよびアポトーシス関連蛋白発現量を測定する。

研究成果

• [雑誌論文] The complexity of EGFR exon 19 deletion and L858R mutant cells as assessed by proteomics, transcriptomics, and metabolomics (2023)
  • 著者名/発表者名: Ochi Nobuaki、Takeyama Masami、Miyake Noriko、Fuchigami Maki、Yamane Hiromichi、Fukazawa Takuya、Nagasaki Yasunari、Kawahara Tatsuyuki、Nakanishi Hidekazu、Takigawa Nagio
  • 雑誌名: Experimental Cell Research 巻: 424 号: 1 ページ: 113503-113503
  • DOI: 10.1016/j.yexcr.2023.113503
  • 査読あり
• [雑誌論文] First and repeat rebiopsy for detecting EGFR T790M mutation in non-small-cell lung cancer: CS-Lung-003 prospective observational registry study (2022)
  • 著者名/発表者名: Kudo Kenichiro、Nishii Kazuya、Makimoto Go、Ishikawa Nobuhisa、Tsubata Yukari、Kodani Masahiro、Fujimoto Nobukazu、Yamasaki Masahiro、Kubota Tetsuya、Takigawa Nagio、Fujitaka Kazunori、Kanaji Nobuhiro、Shibayama Takuo、Itano Junko、Ando Chihiro、Hotta Katsuyuki、Kiura Katsuyuki
  • 雑誌名: Journal of Cancer Research and Clinical Oncology 巻: 148 号: 8 ページ: 1869-1877
  • DOI: 10.1007/s00432-021-03893-z
  • 査読あり
• [雑誌論文] Targeting ROR1 in combination with osimertinib in EGFR mutant lung cancer cells (2021)
  • 著者名/発表者名: Nakagawa N, Miyake N, Ochi N, Yamane H, Takeyama M, Nagasaki Y, Ikeda T, Yokota E, Fukazawa T, Nakanishi H, Harada D, Kiura K, Takigawa N.
  • 雑誌名: Exp Cell Res. 巻: 409 号: 2 ページ: 112940-112940
  • DOI: 10.1016/j.yexcr.2021.112940
  • 査読あり
• [学会発表] EGFR遺伝子変異肺癌におけるROR1標的治療の基礎的検討 (2021)
  • 著者名/発表者名: 三宅規子、越智宣昭、中川 望、竹山雅美、山根弘路、長﨑泰有、岩井美樹、横田悦子、深澤拓也、瀧川奈義夫
  • 学会等名: 第62回日本肺癌学会学術集会