| 研究課題/領域番号 |
21K08247
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分53040:腎臓内科学関連
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| 研究機関 | 群馬大学 |
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研究代表者 |
高木 陽子 群馬大学, 医学部附属病院, 医員 (70813517)
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| 研究分担者 |
小林 靖子 群馬大学, 医学部附属病院, 講師 (60451720)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
4,030千円 (直接経費: 3,100千円、間接経費: 930千円)
2023年度: 1,040千円 (直接経費: 800千円、間接経費: 240千円)
2022年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2021年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
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| キーワード | 微小変化型ネフローゼ症候群 / ノンコーディングRNA / nc886 / ポドサイト |
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| 研究開始時の研究の概要 |
微小変化型ネフローゼ症候群では、Tリンパ球が産生する液性因子が糸球体上皮細胞の機能異常を誘発し蛋白尿を惹起するとされてきたが、この因子はいまだ同定されていない。申請者らは、母アレルインプリント遺伝子であるノンコーディングRNA886(nc886)遺伝子 が高度にメチル化されている個体が患者群で有意に多く、父アレル由来と考えられる発現は患者再発時で有意に低下していることを見出した。本研究では、血球細胞での変化が、同じく中胚葉発生である糸球体上皮細胞の機能異常にどのように関与するか探索するため、nc886の発現変化による糸球体上皮細胞の機能的変化を検討し、病因の一端や新規治療の可能性に迫る。
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| 研究実績の概要 |
令和4年度までに、健常ヒトポドサイト細胞株におけるnc886遺伝子領域のDNAメチル化解析と、健常ヒトポドサイト細胞株における感染モデルとNSモデルでのnc886の発現解析、健常ヒトポドサイト細胞株における感染モデルのアクチンストレスファイバーの形態変化についての検討を行った。
令和5年度は、ノンコーディングRNA886(nc886)のポドサイト機能異常に対する意義を明らかにするため、nc886ノックダウン細胞の作成を試みた。siRNAを用いて健常ヒトポドサイト細胞株とヒト胎児腎由来の細胞株であるHEK293T細胞で作成した。ノックダウンされているかの確認は、①rt-PCR法を用いてnc886発現を測定、②機能的ノックダウンとして、Western Blotting法を用いてPKR活性測定を行った。しかし、データにばらつきを認め再現性に乏しく、安定したノックダウン細胞の作成が困難であった。
今年度は、アンチセンスオリゴやCRISPR/Cas9システムを用いて、ヒト子宮頸がん由来の細胞株であるHeLa細胞にて、nc886ノックダウン/ノックアウト細胞を作成中である。RT-PCR法にてnc886のノックダウンが確認できたら、Western Blotting法にてPKR活性の測定を行い、機能的にもnc886がノックダウンされていることを確認する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
nc886ノックダウン細胞の作成に時間を要しているため。
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| 今後の研究の推進方策 |
Nc886ノックダウン/ノックアウトHeLa細胞の作成が確立されたら、免疫染色にてアクチンストレスファイバーの変化を検討する。ここまでの検討が終了したら、これまでのデータと併せて論文化する。
一方で、HeLa細胞におけるアクチンストレスファイバーの変化が確認されたら、細胞骨格リモデリングに関与するシグナル伝達である、pVASPやRho GTPase、Rac1の変化を検討する。さらに、健常ヒトポドサイト細胞株でも同様の検討を進める。
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