| 研究課題/領域番号 |
21K08475
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分54020:膠原病およびアレルギー内科学関連
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
秋月 修治 京都大学, 医学研究科, 助教 (50626637)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
3,510千円 (直接経費: 2,700千円、間接経費: 810千円)
2023年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
2022年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
2021年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
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| キーワード | 自己免疫疾患 / ホスホリパーゼD4 / トール様受容体 / 全身性自己免疫疾患 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
ホスホリパーゼD4（PLD4）は、遺伝学的研究手法により複数のヒト全身性自己免疫疾患（膠原病）の発病に関わる疾患感受性要因として同定されたが、病態形成における生物学的な経路を含め生化学機序は未知である。本研究は、全身性自己免疫病におけるPLD4の役割を解明することを目的とする。具体的には、遺伝子改変マウスを用い、実験的自己免疫疾患モデルの表現型に及ぼす影響を評価し、PLD4による免疫寛容の維持機構の解明を目標する。また、膠原病患者検体の末梢血細胞、及び血漿中PLD4の発現状態を計測し、臨床情報との相関を検討する。これら動物モデルとヒト臨床検体を対比し、臨床応用への可能性を探索する。
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| 研究実績の概要 |
A. 血漿中遊離型PLD4の定量
ヒト血漿サンプル中の遊離型PLD4を定量し、自己免疫疾患患者と健常者を比較し、臨床的バイオマーカーとなる可能性を追求した。抗ヒトPLD4抗体でELISA系を樹立し、大腸菌由来リコンビナントPLD4をサンプルとした測定系では定量性を持って計測された。他方でヒト血漿検体では段階希釈法で定量性が確認されなかった。ELISA系が適正に働かない原因とし、① 夾雑する他の血漿由来タンパクによる反応阻害、② 使用した抗ヒトPLD4抗体が哺乳類細胞由来PLD4を認識しない可能性を挙げた。まずは後者の抗原抗体反応の適正性を確認するため、PLD4を遺伝子導入したHEK293Tのライセートを用いウェスタンブロットを行った結果、使用した抗ヒトPLD4抗体と哺乳動物細胞発現のPLD4に反応性が確認された。現在は、上記ELISA法の陽性対照とするため、遊離型PLD4を模した分泌型免疫グロブリン定常領域融合PLD4発現ベクターをHEK293Tに遺伝子導入し、タンパク発現を確認した状況である。
B. 患者末梢血単核球（PBMC）におけるPLD4発現プロファイルの計測
ヒトPBMCにおいて、PLD4トランスクリプトはB細胞、単球に選択的に発現するが、健常者と疾患患者の間で差異は認めなかった（2022年度報告）。他方、樹状細胞（DCs）をconventional DCsと形質細胞様樹状細胞（pDCs）を亜分画した結果、pDCsはB細胞、単球に比してPLD4を多く発現することが判明した。pDCs、B細胞、単球は共通してトール様受容体（TLR）7、9を高発現し、一本鎖DNAやRNAを認識し、免疫応答を駆動する。現在は単離したヒトB細胞、単球、pDCsをTLR7、TLR9リガンド存在下で培養し、PLD4トランスクリプト発現を定量する計画である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
公知データベースよりヒト血漿中にPLD4の存在が示されている。また、同一のPLDファミリーであるPLD3は膜貫通領域から酵素活性部位を含むC末端が切断され遊離することが報告されている。この推定される切断部位近傍のアミノ酸配列はPLD3とPLD4で類似性が高く、PLD4が遊離型として存在する可能性がある。そのため、2022年度に続き、膜貫通領域を欠くPLD4の可溶型フォームを検出し、その機能的、臨床的意義の探索を試みているが、現時点ではその存在は証明出来ていない。PLD4 floxマウスを用いた機能解析の研究項目に関しては、2022年度にB細胞特異的Cre発現マウス（Mb1-Cre）と交配し、脾臓の胚中心B細胞、follicular helper T細胞の数的減少を観察したが、生殖細胞系列でCreのリーク発現があり、マウス系統維持を困難とした。そのため、CD19-Creマウス等の他のB細胞特異的Cre発現マウスを導入予定であり、現在、準備中である。
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| 今後の研究の推進方策 |
公知データベースに基づくと、PLD4は他のDNA核酸分解酵素であるDNASE1、DNASE2に比して血漿中に4～5倍濃度での存在が示される。また、これらの他のDNA分解酵素がエンドヌクレアーゼであるのに対し、PLD4は5’-エクソヌクレアーゼ活性が報告される。これらの分子機能的な相違に加え、PLD4は免疫細胞に特異的に発現する点が特徴的であり、免疫システムにリンクした生理機能が推測される。循環血中無細胞DNAが自己免疫疾患で増加していることが知られており、細胞外の遊離核酸を分解する制御機構は疾患バイオマーカーや治療応用としての期待が高い。以上の仮説に基づき、引き続き可溶型PLD4の存在証明と機能追求を目標とする。本課題で準備したポリクローナル抗体を利用したELISA法が血中PLD4の検出に困難であり、まずは可溶型PLD4を模したヒト免疫グロブリン定常領域融合PLD4を作出し、陽性コントロールとして抗体種を変更する等、至適な検出法の樹立を試みる。
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