| 研究課題/領域番号 |
21K08807
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分55020:消化器外科学関連
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| 研究機関 | 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター |
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研究代表者 |
緑川 泰 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター, 病院 総合外科部, 部長 (10292905)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2023年度: 1,040千円 (直接経費: 800千円、間接経費: 240千円)
2022年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
2021年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
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| キーワード | 肝細胞癌 / WNTパスウェイ / ベータカテニン / E-カドヘリン / 細胞悪性度 / 多段階発がん / 次世代シーケンサー |
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| 研究開始時の研究の概要 |
早期肝がんで既にCTNNB1などのドライバー変異が高頻度に認められる一方で、WNT下流遺伝子の発現は変化せず、WNTパスウェイではbetaカテニンの変異に加えてCDH1のプロモータ領域のメチル化による発現低下がbetaカテニンの核移行に必要であることを報告した。本研究ではbetaカテニンの変異を含む肝がん細胞株と野生型細胞株にそれぞれCDH1を過剰発現、ノックアウトすることによりbetaカテニンの核移行の変化が生じ、その結果下流遺伝子が活性化するかどうかを観察する。さらに細胞増殖能・遊走能・浸潤能などへの影響を明らかにし、WNTパスウェイ活性化のためのセカンドヒットを探求する。
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| 研究実績の概要 |
昨年度までに行ったシーケンスによる8種類の肝がん細胞株についてベータカテニンの遺伝子異常については以下の通りである。
ベータカテニンmut:HepG2, Hep3B, PLC/PRF/5, HLE
ベータカテニンWT: Huh7, SH-Hep1
CDH1を強制発現させるために現在まで以下の実験を遂行している。すなわちCDH1の転写領域全長（2,807bp）をpCDH-EF1-T2A-Puro（レンチウィルスベクター）にサブクローニングした。さらに上記のベータカテニンmut の各細胞株にトランスフェクションすることによりE-カドヘリンの発現を誘導し、48時間後に免疫染色によりE-カドヘリンの細胞膜への局在でトランスフェクションの効率については判定した。CDH1発現によるベータカテニンの核への移行の影響についても、免疫染色によりトランスフェクション前後の細胞株を比較検討を行い、高い高率でトランスフェクションが行われていることを確認した。
CTNNB1 mut過剰発現についてもベータカテニンmutを有する細胞株HepG2よりCTNNB1の全長（3,488bp）をサブクローニングした後、トランスフェクションは上記の方法でベータカテニンWT細胞株に行った。さらにこれらのDNA導入した細胞株についてsiRNAによりCDH1をノックダウンすることによりカテニンの核への移行を確認する予定である。
上記で作成した肝がん細胞について、今年度中にRNAシーケンスによりWNT下流遺伝子の発現レベルの 化、WNTパスウェイの活性化を確認する予定である。さらに、上記で作成した細胞株についてそれぞれカドヘリン発現の有無で細胞 殖能、細胞遊走能、細胞浸潤能などを比較し、肝がん細胞の 性化について比較検討する予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
理由
2022年度についての進捗 況は概ね研究計画通りである。
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| 今後の研究の推進方策 |
2021年度で作成したベクター 細胞株について、2023年度以降の実験に使用可能であるかどうかについての確認を今年度に確認した。今後は臨床検体を用いた次世代シーケンサーの結果について、そのメカニズムを解明する実験を行ってゆく。すなわち、ベータカテニンの変異に加えてE-カドヘリン変異というセカンドヒットが必要であるかどうか、さらに実際にWNT 路の活性化が起こることにより細胞の悪性度が加わり進行度の遅い早期肝がんから 悪性度の高い進行肝癌へと移行してゆくかどうかについての実験をおこない、in vitroと実際の生体内で起きている肝がん進展のメカニズムの解明を行うとともに、その研究課程で明らかになるゲノム 化に着目して新規の肝がんに する分子標的治療へと繋げてゆく予定である。
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