| 研究課題/領域番号 |
21K09152
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分56010:脳神経外科学関連
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| 研究機関 | 山口大学 |
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研究代表者 |
崔 丹 山口大学, 大学院医学系研究科, 准教授 (40346549)
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| 研究分担者 |
池田 栄二 山口大学, 大学院医学系研究科, 教授 (30232177)
吉冨 千尋 山口大学, 大学院医学系研究科, 助教 (50819323)
田中 瑛 山口大学, 大学院医学系研究科, 助教 (60913936)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2023年度: 1,040千円 (直接経費: 800千円、間接経費: 240千円)
2022年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2021年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
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| キーワード | 膠芽腫 / 腫瘍幹細胞 / 低酸素 / 低栄養 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
本研究では、極めて悪性度の高い膠芽腫の予後改善さらには根治に向け、新規治療法確立のための標的分子を特定することを目的とする。具体的に明らかにしようとする点は、１）壊死周囲ニッチをスフェロイド培養系にて再現し定量解析可能なin vitro系として確立する、２）壊死周囲ニッチにおけるH+S+/N+R-/low細胞誘導へのNFATc4の関与を明らかにする、３）NFATc4の造腫瘍能・治療抵抗性への寄与を解析し治療標的としての有用性を明らかにする、４）膠芽腫に対する新規治療標的候補を特定する。
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| 研究実績の概要 |
膠芽腫は極めて予後不良な脳腫瘍であり、病態解明および根治できる治療法の開発は急務である。膠芽腫の治療抵抗性や再発の原因には腫瘍幹細胞がある。これまで我々は、膠芽腫の予後不良を規定する腫瘍細胞として、HIF-1α を発現するとともに幹細胞性質を示し静止期にある腫瘍細胞〔HIF-1α+ Sox2+/Nanog+ RNApIIS2P-/low（以下、H+S+/N+R-/low 細胞）〕（Sox2 およびNanog は幹細胞マーカー、RNApIIS2P は増殖期マーカー）を特定し、この細胞が低栄養・低酸素状態を特徴とする壊死周囲ニッチに特異的に存在することを明らかにした。また、ヒト膠芽腫細胞株U87を用い、「壊死周囲ニッチ」を模したスフェロイド（３次元）培養系において、上記のH+S+/N+R-/low 細胞が出現することを再現し、これらH+S+/N+R-/low細胞の一部にはNFATc4の共発現を伴っていることが示された。「壊死周囲ニッチ」に出現する膠芽腫の予後不良を規定するH+S+/N+R-/low細胞の誘導にNFATc4が関わることが、スフェロイド培養系において示唆された。
令和4年度は、ヒト膠芽腫細胞株U87を用いて、ヌードマウス脳に移植し、可視化できる実験系を作成した。方法として、まず、ヒト膠芽腫細胞株U87株にBLIV-MSCV-Luciferrase-EF1a-copGFP-T2A-Puro(BLIV2.0:Plasmid) を導入し、ルシフェラーゼおよび蛍光タンパクGFP(Luciferrase-GFP)を安定的に発現する細胞を樹立する。その後、Luciferrase-GFPを強制発現したヒト膠芽腫由来細胞株U87を平面培養（2次元）し、様々な個数の細胞をヌードマウス脳に移植し、IVIS Imaging Systemで経時的にモニターする。その結果、2.8x105個以上の細胞を移植すれば腫瘍が形成した。また、移植後の１日目から腫瘍を摘出した28日までIVIS Imaging Systemでモニターできることを明らかにした。さらに、Luciferrase-GFPを強制発現したU87でスフェロイドを作製し、ヌードマウス皮下に移植することも成功した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度の研究計画は、マウス脳への移植実験など今後の解析のための条件設定を行う計画であり、平面培養で可視化できる細胞を脳に移植する至適なIVIS Imaging Systemでモニターできる条件を得た。また、スフェロイドをマウス皮下に移植し、至適なIVIS Imaging Systemでモニターできる条件を設定した。スフェロイドのヌードマウス脳への移植実験はやや遅れているが、来年度の解析を順調に行うための条件設定は済んでいる。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後、「壊死周囲ニッチ」を模した条件下で培養したスフェロイドと通常条件下で培養したスフェロイドの腫瘍形成能を比較し、NFATc4の関与を解析する。実験系として、R4で確立したLuciferrase-GFPを強制発現したヒト膠芽腫細胞株U87を低酸素・低栄養条件下、または通常条件下で培養したスフェロイドをヌードマウス脳に移植し、IVIS Imaging Systemでモニター経時的に腫瘍形成を観察する。さらに、NFATc4をノックダウンし、低酸素・低栄養条件下で培養したスフェロイドをヌードマウス脳に移植し、予後不良な膠芽腫の病態へのNFATc4の関与を解析する予定である。
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