神経再生機構における受容体型チロシンキナーゼ新規活性化リガンドの役割

• 研究課題/領域番号: 21K09297
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 基金
• 応募区分: 一般
• 審査区分: 小区分56020:整形外科学関連
• 研究機関: 名古屋大学
• 研究代表者: 町野 正明 名古屋大学, 医学部附属病院, 病院助教 (70807510)
• 研究分担者: 今釜 史郎 名古屋大学, 医学系研究科, 教授 (40467288) ; 安藤 圭 名古屋大学, 医学部附属病院, 講師 (40566973) ; 小林 和克 名古屋大学, 医学部附属病院, 病院講師 (00706294) ; 中島 宏彰 名古屋大学, 医学系研究科, 准教授 (70710101)
• 研究期間 (年度): 2021-04-01 – 2023-03-31
• 研究課題ステータス: 中途終了 (2022年度)
• 配分額: 4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円); 2023年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円); 2022年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円); 2021年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
• キーワード: 受容体型チロシンキナーゼ / 神経再生 / 活性化リガンド

研究開始時の研究の概要

受容体型チロシンキナーゼ（RTK）とそのリガンドは、神経系の発生、分化、生存維持など多彩な生物学的機能を有している。未分化リンパ腫キナーゼ（ALK）は神経系に特異的に発現するRTKの1つであり、特定の神経細胞集団に対して増殖、生存維持などの作用を持つ神経栄養因子、または軸索誘引・反発作用などを持つ位置情報因子に対する受容体として機能していることが期待されているが、ALKに対するリガンドは現在未同定でありその詳しい機能は不明である。本研究の目的はALKのリガンドを特定し、ALKの活性化により引き起こされるシグナル伝達経路の解析および細胞レベルでのALKの機能解析を行うことである。

研究実績の概要

未分化リンパ腫キナーゼ（ALK）は、受容体型チロシンキナーゼ（RTK）ファミリーに属するI型膜貫通型タンパク質であり、その細胞内チロシンキナーゼ活性は、特定のリガンドによる受容体クラスタリングによって増強される。本研究は、コンドロイチン硫酸（CS）またはデルマタン硫酸（DS）など他のグリコサミノグリカン（GAG）がALKのリガンドであるかどうかを検証することを目的とした。
表面プラズモン共鳴（SPR）分析にて、DSはN末端領域（NTR）のNTRとの有意な相互作用を示したが、他の硫酸化パターンを含むCSフォームは未分化リンパ腫キナーゼ（ALK）に結合しなかった。Western blotting法にてDS二糖（dp2）を除いて、DS四糖（dp4）より長いDSは、ALKの自己リン酸化を用量依存的に誘導し、ALKの活性化を促した。dp4より長いDSはALKの自己リン酸化を濃度依存的に誘導しALKを活性化した。ALKのNTRの重要性にさらに取り組むために、全長ALKとNTRを欠く短縮型ALK（ALKΔNTR）をHEK293T細胞に過剰発現させた。その後、細胞溶解物をビオチン結合DSと混合し、ストレプトアビジンでプルダウンした。ALKΔNTRはDSによってプルダウンされず、全長ALKはDSによって正常にプルダウンされた。これによりDSがALKのNTRの特異的リガンドであることを確認した。2.5μMのDS dp16および天然DSは、全長のALKを活性化したが、一貫してALKΔNTRの活性化を誘導できなかった。DSがALKの新しいリガンドであることが証明された。DSはALKのNTRと直接相互作用し、DS四糖はALKの活性化に十分な誘導能を示した。