膜タンパク陽性エクソソームによる肉腫の超早期診断法の開発と、膜タンパクの機能解析

• 研究課題/領域番号: 21K09318
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 基金
• 応募区分: 一般
• 審査区分: 小区分56020:整形外科学関連
• 研究機関: 福井大学
• 研究代表者: 渡邉 裕美子 福井大学, 学術研究院医学系部門(附属病院部), 医員 (50893830)
• 研究分担者: 松峯 昭彦 福井大学, 学術研究院医学系部門, 教授 (00335118) ; 田中 太晶 福井大学, 学術研究院医学系部門, 講師 (00796245) ; 出淵 雄哉 福井大学, 学術研究院医学系部門, 特別研究員 (20795041)
• 研究期間 (年度): 2021-04-01 – 2024-03-31
• 研究課題ステータス: 交付 (2022年度)
• 配分額: 4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円); 2023年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円); 2022年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円); 2021年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
• キーワード: 肉腫 / エクソソーム / リキッドバイオプシー / エクソソーム膜タンパク / 膜タンパクA / エクソソーム膜 / 膜タンパクA陽性エクソソーム

研究開始時の研究の概要

近年、癌患者の末梢血中の “エクソソーム”と呼ばれる細胞外小胞の存在が注目されている。我々は、膜タンパクAが、肉腫細胞で特異的に発現することを見いだした。そして、膜タンパクAは肉腫細胞から分泌されるエクソソーム膜にも存在することを確認した。本研究では、肉腫再発・転移の早期発見を目指して、膜タンパクA陽性エクソソームを測定するためのイムノアッセイ法を確立するとともに、１細胞遺伝子発現解析などで膜タンパクAの機能解析を行い、膜タンパクAが肉腫の新規治療ターゲットとなる可能性を検討する。

研究実績の概要

マウス骨肉腫高肺転移株LM8とその親株であるDann骨肉腫細胞株（低肺転移株）の培養上清よりエクソソームをペレットダウン法で回収し、mass spectrometerを用いてプロテオーム解析を行い、さらに細胞株のcDNAマイクロアレイデーター、Pathway解析を参考にして10種類のタンパクを肺転移関連エクソソーム膜タンパクXｓとして同定した。現在、分子量約64kDaの膜タンパクAを中心に解析を行っており、多くの肉腫細胞株や癌細胞株で高発現していることや、免疫組織学的染色により肉腫の80%で高発現していることを確認した。nativeな膜タンパクAを検出できる新規マウスモノクローナル抗体をDNA免疫法で作成、CD9/膜タンパクAエクソソームELISA kitを独自に構築することに成功した。肉腫患者35例と、コントロール群15例（良性腫瘍患者8例、非腫瘍性運動器疾患患者7例）の血清膜タンパクA陽性エクソソーム量を測定した。肉腫別や患者背景による膜タンパクA陽性エクソソーム量を統計解析し、イムノアッセイ法の確立を目指している。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

nativeな膜タンパクAを検出できる新規マウスモノクローナル抗体をDNA免疫法で作成、CD9/膜タンパクAエクソソームELISA kitを独自に構築することに成功した。肉腫患者や良性腫瘍患者は、生検時や手術時には必ず腫瘍組織と、血液を採取しており、比較検討するには十分な検体を保持している。肉腫、良性腫瘍に加え、非腫瘍性運動器疾患、健常者の血清も採取しサンプルを用意した。膜タンパクＡエクソソーム量を測定するkitを作成し、上記のサンプルに対して測定を行った。現在、測定結果を解析中である。解析結果をもとに、イムノアッセイ法を確立することができると考えている。

今後の研究の推進方策

肉腫患者、良性腫瘍患者、非腫瘍運動器疾患の腫瘍組織、血清を引き続き収集し、CD9/膜タンパクAエクソソームELISA kitで測定し、解析する母数を増やしていく。膜タンパクAの生物学的機能を解析をすすめる。血清膜タンパクA陽性エクソソームが分泌されていた患者の肉腫の種類や、腫瘍組織での染色性、患者背景などを合わせて統計解析をすすめる。膜タンパクAの強制発現や、shRNAでのノックダウンによる造腫瘍性・転移能の変化などをin vitro, in vivoで観察し、肉腫細胞における膜タンパクAの機能解析を行っていく。