| 研究課題/領域番号 |
21K09499
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分56040:産婦人科学関連
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| 研究機関 | 名古屋市立大学 |
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研究代表者 |
鈴森 伸宏 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 准教授 (70326148)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2023年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
2022年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2021年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
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| キーワード | 胎児染色体 / 流産 / トリオ分析 / エクソーム解析 / 胎生期形態異常 / 不育症 / 遺伝子解析 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
加齢とともに流産率や胎生期形態異常の発生率は上昇し、自然流産のうち80％以上の胎児に染色体・形態異常がみられる。妊娠初期から胎児成分は母体免疫系に認識され母体血中に混入しているが、胎生期形態異常があると脱落膜付近でバリアが形成される。これは母体側の脱落膜において、胎児成分を認識して、免疫・血管新生、妊娠維持機構の破綻を招くと考えられる。しかし、どのようなプロセスをへて、流産の転帰となるのか分かっていない。本研究の目的は、胎生期形態異常の有無を分別し、流産の原因・機序を解明し、トリオ分析で着床前診断へつなげることである。本研究の発展により、流産の予防・予知の解明に広がっていくことが期待できる。
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| 研究実績の概要 |
流産・死産児について、胎児染色体異常・胎生期形態異常の原因分析として、胎児形態分析を行い、外表奇形等の形態を調べている。2回以上流産・死産を繰り返す不育症症例については、流産時に全症例の絨毛染色体分析で核型を調べ、夫婦と胎児（絨毛）でトリオ分析を実施している。
流産・死産の原因解明のためのトリオ分析として、複数回の流産・死産例で原因不明の不育症の21家系において調べ、夫婦と絨毛の染色体分析で全て正常核型の16家系を研究対象とした。説明と同意のうえで、夫婦の末梢血、または唾液よりゲノムDNAを抽出、絨毛成分よりゲノムDNAを抽出、16家系、48検体を解析対象としている。全エクソーム解析によるトリオ分析は、蛍光法を用いたDNAの定量、Agilent社 TapeStationを用いたDIN値の測定によるDNA分解の有無を確認し、SureSelect XT Reagentを用いてライブラリ調製を行い、SureSelect Human All Exon Kitを用い、エクソン領域のキャプチャーを行なった。シーケンスにはNovaSeq6000を使用している。
シーケンスデータは全エクソーム解析プログラムにて、参照配列にマッピングしている。全エクソーム解析によるトリオ分析について、ホモ接合体変異や複合ヘテロ接合体変異、病的バリアントの有無を解析している。臨床ゲノム情報統合データベース等のデータベース分析、PubMedでVariantについて検索している。
最終目的となる着床前診断へ応用としては、ゲノムDNAのトリオ分析で、夫婦の病的バリアントで起きる重篤な遺伝性疾患と判断される症例の有無を確認する。トリオ分析で遺伝的要因が明らかなときは、着床前診断の対象症例として考慮する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
対象者は29-40歳の不育症女性とその夫、胎児（流産絨毛）とし、2-6回の初期流産歴を有して出産既往は問わないとした。夫婦と胎児（絨毛）のトリオ分析として、2回以上の原因不明の流産・死産例、21症例のうち、夫婦・胎児（絨毛）の染色体分析にて全て正常核型の16家系、48検体を解析対象とした。また、不育症精査にて原因不明、絨毛染色体検査にて染色体正常核型を対象とした。夫婦の末梢血または唾液、胎盤の絨毛成分よりゲノムDNAを抽出して、16家系、48検体全てを用いて全エクソーム解析によるトリオ分析を行い、ホモ接合体変異や複合ヘテロ接合体変異、病的バリアントの有無を解析している。
Germline mutationの検出は、Genomon-exomeを用いて行った。配列リードはBurrows-Wheeler Alignerを用いてhg19ゲノムをコントロールとし、VariantはPicard toolsを用いてPCR duplicateを除去し、VarScan2を用いて検出した。Variant allele frequency>0.2 (20%) をカットオフ値とした。ACMGのガイドラインにより、(1) ESP6500 exome variant server、(2) 1000 genomes projectでマイナーアレル頻度が1%を超えるSNPsを除去した。このVariantは、病原性が既に報告された原因Variant、あるいは関連するリスクを引き起こすと強く予想されるVariantとした。各Variantの具体的な病原性については、NCBIのHuman Genome Mutation Database、PubMedにより検討している。
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| 今後の研究の推進方策 |
16家系、48検体全てを用いて全エクソーム解析によるトリオ分析を行い、ホモ接合体変異や複合ヘテロ接合体変異、病的バリアントの有無を解析していく。これまでの検討で、胎児（絨毛）に引き継がれたRare variantが、有意に母由来のものがあり、絨毛として全エクソーム解析をしていたものの母由来のDNA混入によるものと考えられる検体については、改めて母由来のDNA混入のない検体に替えて再解析を行っていく。
また、臨床ゲノム情報統合データベースなどのデータベース分析をして、PubMed検索でVariantの意義について詳しく調べていく方針である。最終目的となる着床前診断へ応用としては、ゲノムDNAのトリオ分析で、夫婦の病的バリアントで起きる重篤な遺伝性疾患と判断される症例の有無を確認する。トリオ分析で遺伝的要因が明らかなときは、着床前診断の対象症例として考慮する。
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