| 研究課題/領域番号 |
21K09765
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分56070:形成外科学関連
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| 研究機関 | 神戸大学 |
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研究代表者 |
榊原 俊介 神戸大学, 医学部附属病院, 特命講師 (50444592)
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| 研究分担者 |
野村 正 神戸大学, 医学部附属病院, 准教授 (30529566)
高須 啓之 山口大学, 医学部附属病院, 准教授 (40566022)
寺師 浩人 神戸大学, 医学部附属病院, 教授 (80217421)
藤井 美樹 順天堂大学, 大学院医学研究科, 准教授 (80444602)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2024年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2023年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2022年度: 780千円 (直接経費: 600千円、間接経費: 180千円)
2021年度: 780千円 (直接経費: 600千円、間接経費: 180千円)
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| キーワード | 抗菌ペプチド / denensin / 創傷治癒 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
生体は微生物との間で抗菌ペプチド(antimicrobial peptides: 以下AMPs)を介して個体間のクロストークを行い、適切な距離を保ちながら共存している。我々ヒトでは、加齢や糖尿病、乾癬などの内因によりAMPsの発現は低下し、このことが易感染性に繋がるとされている。またAMPsは生物種の進化とともにそれぞれに環境に適した変化をしており、生物種間で抗菌スペクトラムの多様性をもつこともその特徴である。peptideゆえに遺伝子操作により細胞に発現を促すことも可能である。本研究ではこの特性を利用し、将来的な臨床使用に向けての基盤形成を目的とする。
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| 研究実績の概要 |
われわれは抗菌ペプチドであるdefensinに注目し、これを培養細胞において強制的に発現させることで細胞が感染への抵抗性を示すことを確認することを第一の目標とした。human defensinはアルファ型とベータ型とに分類され。さらにそのサブファミリーが存在する。これらはそれぞれに抗菌スペクトラムや発現部位が異なることが明らかとなっている。われわれはhuman beta defensin-3に注目した。本ペプチドは広い抗菌スペクトラムを持つためである。
まずカスタム合成によりhuman defensin-3の全長配列を含む発現ベクターを次の通り構築した。1. DYKタグをhuman defense-3のC末端に付加したもの、2. バイダイレクショナルベクターであるpBIに組み込んだもの、3.pBAに組み込んだもの を作成した。1.をヒト線維芽細胞に導入したのち、培養上澄を回収し、これに対して抗DYK抗体を用いて発現を確認したところ、確かにDefensin-3が発現し、かつ、細胞外に分泌されていることが明らかとなった。次にpBIに組み込んだものを線維芽細胞に導入し、導入効率を確認するために蛍光タンパク質を用いて観察したところ、トランスフェクション試薬を利用した場合は細胞死率が高く、導入効率が低かったため、エレクトロポーレーショんによる導入とした。この結果をもとにpBAに組み込んだものを利用し、western blottingにより定量観察を行ったがup-regurationが認められなかった。培養上澄により希釈されている可能性を考慮し、BSAに対する抗体によりベースラインを作成することとし、現在、継続している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
発現系の確率が行えた。
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| 今後の研究の推進方策 |
上記2.により蛍光を用いて導入効率を確認しながらhuman defensin-3の発現を確認する。さらにBSAを基準としながら上記3.（pBAに組み込んだもの）を線維芽細胞に導入し、一定の発現が確認されたのち、細菌との共培養により生存確率の上昇が認められるのかを検証する。
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