研究課題/領域番号 |
21K09824
|
研究種目 |
基盤研究(C)
|
配分区分 | 基金 |
応募区分 | 一般 |
審査区分 |
小区分57010:常態系口腔科学関連
|
研究機関 | 和歌山県立医科大学 (2022) 大阪歯科大学 (2021) |
研究代表者 |
納富 拓也 和歌山県立医科大学, 医学部, 講師 (70542249)
|
研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
|
研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
|
配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2023年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
2022年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2021年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
|
キーワード | 破骨細胞 / 力学的刺激 |
研究開始時の研究の概要 |
破骨細胞分化方向を決定する力学的閾値とそれを土台とする力学的刺激記憶機構の同定を目指すため、以下の3計画を実施する。 (1) 力学的閾値同定のための力学的刺激条件について、TRAP活性を指標としてスクリーニングを行い、(2) その閾値以上・以下で発生する個々のメカニズム・力学的刺激記憶機構について、関連分子の同定と膜電位の新観点(膜電位の光操作を行う)から、明らかとする。(3) 生体内での力学的閾値・力学的刺激記憶機構の存在を、マウスに運動力学的刺激(スクリーニングした力学刺激条件・標的分子阻害薬物)を与えて検証して、骨代謝コントロールにつなげる。
|
研究実績の概要 |
骨中力学的刺激伝達機構の研究は、力学的刺激応答性の明確な骨芽細胞を中心に発展しており、骨吸収を担う破骨細胞では、ほとんど検討されていない。特に、破骨細胞分化と力学的刺激について、その影響は刺激条件次第で正反対の結果(分化促進もしくは抑制)となる。これは、破骨細胞の力学的刺激応答性に力学的閾値(Mechano-threshold)が存在することを示す。本計画では、破骨細胞分化方向を決定する力学的閾値を仮定して、それを土台とする力学的刺激記憶機構(Mechano-memory:力学的刺激終了後、長期に渡り細胞内シグナル伝達機構が活性化され続ける)の同定と解明に挑む。 本年度では、力学的閾値のスクリーニング結果に基づき、その再現性とシグナル伝達機構の重要分子について検討を進めた。長期間(7日間以上)の力学的刺激後にERK比率(リン酸化ERK/全ERK)が増加していることを背景として、グルタミン酸受容体(NMDA受容体)を標的分子の一つとして検討した。NMDA受容体のサブユニットのNR1が破骨細胞前駆細胞にて検出されて、免疫染色により、その局在を確認した。また、NMDA受容体の可逆的阻害薬を伸展刺激時に添加すると、長期伸展刺激後のERK比率増加が認められなかった。TRAP活性減少条件下(力学的閾値以上の伸展条件)において、NMDA受容体阻害薬を添加すると、力学的刺激による破骨細胞分化抑制効果が確認されなかった。これは、RAW細胞および骨髄由来細胞の破骨細胞を用いた検討においても、同様の結果が得られた。
|
現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
力学的刺激記憶機構(長期間刺激後の持続的シグナル変化)との関連については、グルタミン酸受容体を代表として、いくつかの標的候補分子を薬物スクリーニングにて確認しつつあるが、再現性を得るために時間を要する。また、候補分子をCRISPR/CAS9システムにて欠損させたRAW細胞を作成中である。それらを用いながら、力学的刺激閾値との関係性を検討している。
|
今後の研究の推進方策 |
力学的刺激閾値のスクリーニングについては再現性がとれてきており、閾値前後の条件を用いて実験を進めていく。破骨細胞分化との関連性について、迅速に評価をおこなうために、引き続きTRAP activityを指標として検証する。標的分子については、分子数を絞って、CRISPR/CAS9による遺伝子欠損細胞を順次作成していく。作成済みの遺伝子欠損細胞では、遺伝子欠損の検証をウエスタンブロッティング法にて行ったのち、実験に用いる。マウスを用いた実験については、野生型マウスに、細胞レベルでの閾値条件と類似した負荷をかけて、生体内での閾値の存在を検証する。
|