軟骨分化過程における関節表層細胞のエピゲノム解析

• 研究課題/領域番号: 21K09845
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 基金
• 応募区分: 一般
• 審査区分: 小区分57020:病態系口腔科学関連
• 研究機関: 昭和大学
• 研究代表者: 安原 理佳 昭和大学, 歯学部, 講師 (20453649)
• 研究分担者: 田中 準一 昭和大学, 歯学部, 講師 (40710166) ; 美島 健二 昭和大学, 歯学部, 教授 (50275343)
• 研究期間 (年度): 2021-04-01 – 2024-03-31
• 研究課題ステータス: 交付 (2022年度)
• 配分額: 4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円); 2023年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円); 2022年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円); 2021年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
• キーワード: 骨格形成 / 軟骨 / エピジェネティクス / 幹/前駆細胞 / 亜鉛トランスポーター / 関節表層細胞 / 骨格成長

研究開始時の研究の概要

本研究課題は、亜鉛の幹細胞に対する作用に着目し、関節表層に存在する組織幹細胞のエピジェネティック制御機構を解明することで、生体内での効率的な硝子軟骨の再生を目指す。近年、エピジェネティクスによる遺伝子発現制御が細胞の厳格な運命づけに重要であり、エピゲノムの解明が疾患制御の要であると考えられていることからCRISPR/Cas9を応用したゲノム編集法を用いることで特定領域の化学修飾を操作する。関節前駆細胞を活かし、再生困難とされる硝子軟骨へ誘導しようとする本研究成果はゲノム編集技術を応用した副作用の少ない新たな遺伝子治療への基盤研究となる。

研究実績の概要

本研究課題では、関節軟骨障害の修復起点としての関節表層細胞に着目した軟骨分化機構の解明を目的とした。中でも、遺伝子発現制御を担うDNAメチル化やヒストンの化学修飾変化が細胞の記憶とその機能発現に重要であることから、特に細胞内外の亜鉛濃度の変化によるエピジェネティクスな制御による骨格変化を解析した。亜鉛トランスポータZIP10欠損マウスを用いて細胞内外の亜鉛濃度の変化にともなう骨格解析を行ってきた。ZIP10欠損マウスは、四肢短縮に加え全身の骨格障害を生じ、ZIP10を欠損した骨芽細胞は骨化能が低下した。関節の成長板の軟骨細胞の不規則な配列と骨化の促進がみられ、軟骨分化異常が生じていると考えられた。表層細胞は、軟骨細胞へ誘導可能な前駆細胞様の性質を保持しており、RNA-sequence法を用いた網羅的発現解析から、骨代謝調節の異常と細胞の生死、エキソソームなどの細胞外vesicleを制御していた。表層細胞が保持する幹細胞や前駆細胞といった未分化な状態の細胞は、環境因子の影響を受け分化が進行することか ら、細胞内外の亜鉛濃度の変化は幹細胞や前駆細胞の細胞環境に大きく影響し、DNAのメチル化や転写因子の結合配列の化学修飾などエピジェネティクスな制御が働くことで細胞分化異常を生じると予想された。今後は、Zip10の発現制御下での軟骨分化過程におけるDNAやヒストンの化学修飾変化を検討し骨代謝調節因子を制御する候補因子のDNAをターゲットとしたCRISPR/Cas9 を用いた脱メチル化システムを構築する予定である。クロマチンレベルのエピゲノム解析には、scATAC-seqが有効であり、シングルセルレベルでの遺伝子発現制御についても解析を進めていく予定である。

現在までの達成度 (区分)

4: 遅れている

理由

Zip10CreER- Rainbow マウスを作製し、タモキシフェン投与することでZip10 陽性細胞を標識し、標識細胞のクローンを組織学的に解析する予定であったが、 Creマウスの発現の変動が大きく、樹立した別の相同組換えクローンを用いて作製を進めてきた。これらのマウスから細胞を採取してin vitroの実験にシフトしていく予定である。

今後の研究の推進方策

軟骨分化に対する3次元培養系を用いて、表層細胞から軟骨分化過程におけるDNAやヒストンの化学修飾変化をZip10の発現制御下で解析する予定である。軟骨分化におけるH3K27me3による転写抑制レベルやそれをとりまくポリコム蛋白複合体の変化について解析を進めていく。

研究成果

• [雑誌論文] Isolation and Functional Analysis of Myoepithelial Cells from Adult Mouse Submandibular Glands. (2023)
  • 著者名/発表者名: Rika Yasuhara, Seya Kang, Rino Tokumasu, Kenji Mishima.
  • 雑誌名: Methods Mol Biol. 巻: -
  • DOI: 10.1007/7651_2022_472
  • 査読あり
• [雑誌論文] Adipose-derived mesenchymal stem cells promote salivary duct regeneration via a paracrine effect. (2023)
  • 著者名/発表者名: Seya Kang, Rika Yasuhara, Rino Tokumasu, Takahiro Funatsu, Kenji Mishima.
  • 雑誌名: J Oral Biosci. 巻: 65(1) 号: 1 ページ: 104-110
  • DOI: 10.1016/j.job.2023.01.006
  • 査読あり
• [雑誌論文] Transcriptome profiles associated with human periodontal ligament differentiation. (2023)
  • 著者名/発表者名: Yuji Takahashi, Rika Yasuhara, Junichi Tanaka Haruhisa Nakano, Koutaro Maki, Kenji Mishima.
  • 雑誌名: J Oral Biosci. 巻: 65(1) 号: 1 ページ: 40-46
  • DOI: 10.1016/j.job.2023.01.005
  • 査読あり
• [雑誌論文] Human induced pluripotent stem cell-derived salivary gland organoids model SARS-CoV-2 infection and replication. (2022)
  • 著者名/発表者名: Junichi Tanaka, Hidenobu Senpuku, Miho Ogawa, Rika Yasuhara, Shintaro Ohnuma, Koki Takamatsu, Takashi Watanabe, Yo Mabuchi, Shiro Nakamura, Shoko Ishida, Tomohiko Sadaoka, Takashi Takaki, Tatsuo Shirota, Toshikazu Shimane, Tomio Inoue, Takayoshi Sakai, Munemasa Mori, Takashi Tsuji, Ichiro Saito, Kenji Mishima
  • 雑誌名: Nat Cell Biol. 巻: 24(11) 号: 11 ページ: 1595-1605
  • DOI: 10.1038/s41556-022-01007-6
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Role of Snai2 and Notch signaling in salivary gland myoepithelial cell fate. (2022)
  • 著者名/発表者名: Rika Yasuhara, Seya Kang, Tarou Irie, Yo Mabuchi, Satoko Kujiraoka, Akane Yukimori, Shoko Ishida, Junichi Tanaka, Kenji Mishima
  • 雑誌名: Lab Invest. 巻: 102(11) 号: 11 ページ: 1245-1256
  • DOI: 10.1038/s41374-022-00814-7
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Assessment of MEF2C as a novel myoepithelial marker using normal salivary gland and pleomorphic adenoma: An immunohistochemical study (2022)
  • 著者名/発表者名: Takakura Ikuko、Kujiraoka Satoko、Yasuhara Rika、Tanaka Junichi、Ide Fumio、Mishima Kenji
  • 雑誌名: Journal of Oral and Maxillofacial Surgery, Medicine, and Pathology 巻: NA 号: 4 ページ: 523-530
  • DOI: 10.1016/j.ajoms.2022.01.001
  • 査読あり
• [雑誌論文] Induction of salivary gland-like cells from epithelial tissues transdifferentiated from mouse embryonic fibroblasts (2022)
  • 著者名/発表者名: Katada Ryogo、Tanaka Junichi、Takamatsu Koki、Hata Kenji、Yasuhara Rika、Ohnuma Shintaro、Takakura Ikuko、Nishimura Riko、Shirota Tatsuo、Mishima Kenji
  • 雑誌名: Biochemical and Biophysical Research Communications 巻: 586 ページ: 55-62
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2021.11.064
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] In vitro monitoring of HTR2A-positive neurons derived from human-induced pluripotent stem cells (2021)
  • 著者名/発表者名: Nakai Kento、Shiga Takahiro、Yasuhara Rika、Sarkar Avijite Kumer、Abe Yuka、Nakamura Shiro、Hoashi Yurie、Kotani Keisuke、Tatsumoto Shoji、Ishikawa Hiroe、Go Yasuhiro、Inoue Tomio、Mishima Kenji、Akamatsu Wado、Baba Kazuyoshi
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 11 号: 1 ページ: 15437-15437
  • DOI: 10.1038/s41598-021-95041-3
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [学会発表] Epithelial-mesenchymal properties are regulated by Snai2 in salivary myoepithelial cells (2022)
  • 著者名/発表者名: Rika Yasuhara, Seya Kang, Satoko Kujiraoka, Akane Yukimori, Shoko Ishida, Junichi Tanaka, Kenji Mishima
  • 学会等名: 第111回日本病理学会
• [学会発表] 唾液腺再生にむけた筋上皮細胞の可塑性制御の分子機序 (2022)
  • 著者名/発表者名: 安原 理佳
  • 学会等名: 第66回日本日本唾液腺学会
  • 招待講演
• [学会発表] Generation of artificial salivary glands using decellularization method (2022)
  • 著者名/発表者名: 大沼慎太郎，美島 健二，安原 理佳，田中 準一，行森 茜
  • 学会等名: 第64回日本日本歯科基礎医学会学術大会
• [学会発表] ヒト多能性幹細胞由来神経堤細胞を用いた歯根膜再生の基盤研究 (2022)
  • 著者名/発表者名: 高橋 侑嗣，安原 理佳，田中 準一，槇 宏太郎，美島 健二
  • 学会等名: 第64回日本日本歯科基礎医学会学術大会
• [学会発表] A comprehensive analysis of ChIP-seq-based Foxc1 target genes in mouse embryonic submandibular gland (2022)
  • 著者名/発表者名: 行森茜、田中準一、大沼慎太郎、安原理佳、大庭伸介、美島健二
  • 学会等名: 第64回日本日本歯科基礎医学会学術大会
• [学会発表] 唾液腺の再生医学:オルガノイド作製とその再生医療への応用 (2021)
  • 著者名/発表者名: 安原理佳
  • 学会等名: 第65回日本唾液腺学会学術集会
  • 招待講演