| 研究課題/領域番号 |
21K09910
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分57030:保存治療系歯学関連
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| 研究機関 | 九州歯科大学 |
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研究代表者 |
折本 愛 九州歯科大学, 歯学部, 助教 (30710967)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2023年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2022年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2021年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
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| キーワード | 無限分裂歯髄幹細胞 / ヒト歯髄幹細胞 / 無限分裂細胞 / 無限分裂化歯髄幹細胞 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
歯髄を喪失すると、歯の強度と機能が低下し、歯の喪失リスクが増大する。しかし、現状では、深い齲蝕や歯髄炎に対して歯髄を除く「抜髄」治療が広く行われている。抜髄を回避するためには、傷害が歯冠部等の局所歯髄に限局している間に炎症を制御し、残存する歯髄を再生させる新規治療法の開発が必要である。これに関する研究の最終目標は、歯髄を構成する各細胞種の炎症応答を統合的に制御し、象牙質・歯髄複合体を局所再生する治療法の開発である。最終目標に到達するために、本研究では、象牙質-歯髄複合体の創傷治癒・再生メカニズムを包括的に解析するための無限分裂ヒト歯髄幹細胞を応用したin vitro研究システムを確立する。
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| 研究実績の概要 |
これまでに、ヒト歯髄幹細胞に変異型サイクリン依存性キナーゼ4(CDK4R24C)、サイクリンD1(CyclinD1)、テロメア逆転写酵素(TERT)の3 種類の遺伝子の発現により、分化能力および元の 染色体パターンを維持したまま細胞分裂が劇的に加速される効率の良い無限分裂ヒト歯髄由来幹細胞hDPSC-K4DTを作出している。しかし、変異型 CDK4、サイクリン D、TERT の定常的導入細胞は、強い細胞増殖を誘導するが、その強い細胞増殖が 細胞分化を阻害する可能性がある。そのため、薬剤の有無によって、変異型 CDK4、サイクリン D の発現を ON/OFF できる薬剤誘導型無限分裂ヒト歯髄幹細胞を改変を試みた。変異型 CDK4、サイクリン D のON/OFFを可逆的に調節できる薬剤誘導型無限分裂ヒト歯髄幹細胞の樹立のために、ドキシサイクリン (Dox) 誘導型の変異型 CDK4及びサイクリン D の両遺伝子の発現レトロウイルスとTERTを発現する混合レトロウイルス溶液を作製し、濃縮後、ヒト歯髄幹細胞に感染を行った。感染後の細胞をDox を投与する群としない群に分けて細胞増殖活性を測定した。詳細には、 開始時に 同じの細胞数を 35 mm dish へ播種し、１日、３日、４日と培養後、ウェルの細胞をトリプシン処理し、剥離した。 全てのウェルに存在した細胞数を計測した。Dox を投与した群では、Dox依存的な無限分裂歯髄幹細胞の増殖能の制御が観察された。さらに、改変細胞の骨分化誘導能力をqPCRとアリザリンレッド染色にて検討したところ、既存のhDPSC-K4DTと比較して、有意に高い骨分化誘導能を持つことが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
Tet off型発現誘導型の変異型 CDK4及びサイクリン D の両遺伝子を持つレトロウイルスベクターに構築、ウイルスの作製、その組み換えウィルス溶液を細胞への感染させることができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
薬剤誘導型に無限分裂ヒト歯髄幹細胞を改変細胞のキャラクターを検証する。PCR、ウエスタンブロットにて導入遺伝子の検出を行う。TERTは、ストレッチPCR法でテロメア配列の伸長活性を検出する。その後、無限分裂に至ったことを連続パッセージにより確認する。
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