| 研究課題/領域番号 |
21K10073
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分57060:外科系歯学関連
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| 研究機関 | 広島大学 |
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研究代表者 |
谷本 圭司 広島大学, 原爆放射線医科学研究所, 准教授 (90335688)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2023年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2022年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2021年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
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| キーワード | Hypoxia / siRNA / hypoxia / molecular target / gene expression / oral cancer / HIF / がん分子標的治療 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
がん分子標的薬開発への直結を目指し，がん細胞の生死を指標としたスクリーニングとがん特有の微小環境である低酸素シグナル制御遺伝子の情報を掛け合わせて選ばれた候補遺伝子の有用性を評価し，機能解析により得られた情報から効果や副作用の応答予測開発を行う。ヒトゲノムsiRNAライブラリーを用いた遺伝毒性スクリーニングと，RNAシークエンス解析から，低酸素環境下で発現量が調節されていて，がん細胞の生死に関わる分子を同定し，様々な臓器由来のがん細胞やヌードマウス移植がん細胞を用いて，その抗がん分子標的としての有用性を検証する。一方，遺伝子機能も明らかにし，機能に基づく治療応答性予測法を開発する。
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| 研究実績の概要 |
がん分子標的薬開発への直結を目指し，がん細胞の生死を指標としたスクリーニングとがん特有の微小環境である低酸素シグナル制御遺伝子の情報を掛け合わせ て選ばれた候補遺伝子の有用性を評価し，機能解析により得られた情報から効果や副作用の応答予測開発を行うことを目指して，本研究を開始した。 これまでに，HeLa細胞を用いたRNAシークエンス解析から低酸素環境で重要な働きをしている転写因子HIF-1α，HIF-2α，DEC1およびDEC2の標的遺伝子を同定し ている。さらに，口腔扁平上皮癌細胞HSC2を用いた同様のRNA-seq解析およびMicroarray解析をするべく，CRISPR-Cas9システムを用いたゲノム編集によるノックアウト細胞を準備している。さらに， ヒトゲノムsiRNAライブラリーからKinase(528 genes)，Ubiquitination(202)，Oxidoreductase(202)，Nuclear hormone receptor(47)， Chromatin regulator(154)の計1133遺伝子に対するsiRNAをHSC2細胞に導入し，通常酸素環境下(21% O2)および低酸素環境下(1% O2)の細胞増殖能に与える 影響を評価した。低酸素環境下のみで細胞増殖を抑制している102遺伝子，低酸素環境下のみで増殖を促進している18遺伝子など，特徴的な機能遺伝子が多数見出されており，バリデーションにより，その普遍性の確認作業を進めている。一方，酸素濃度 に依存せず，抗腫瘍効果を示すsiRNAも複数見出されており，興味深い。キナーゼ遺伝子の中には，既に分子標的薬が開発中とされ ているCDK6遺伝子やAURKA遺伝子などが見出されており，実験の妥当性を示していると考えている。 個々の遺伝子機能の評価などを現在進めている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ヒトゲノムsiRNAライブラリーを用いたスクリーニングは現在計1133遺伝子まで進んでおり，有望な遺伝子も多数みつかっているため順調である。
網羅的遺伝子解析や機能解析にsiRNAを用いたノックダウンをおこなってきたが，CRISPR-Cas9を用いたノックアウト細胞を用いるべく，複数の細胞のクローニング中であり，時間を要している。
一方，コロナ 禍の輸送制限などによるsiRNAを含む試薬や解析サンプル輸送などの停滞で，予想以上に時間を要する部分もある。
全体としては順調と言える。
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| 今後の研究の推進方策 |
口腔扁平上皮癌細胞HSC2を用いたRNA-seq解析およびMicroarray解析のため，CRISPR-Cas9を用いて，HIF1A，EPAS1（HIF2A），BHLHE40（DEC1），BHLHE41（DEC2），ARNT，VHL遺伝子ノックアウト細胞を作製中である。予定外ではあるが，siRNAを用いたノックダウンより，詳細で正確な解析を計画している。 また，ヒトゲノムsiRNAライブラリーを用いたスクリーニングは，対象遺伝子の拡大を進めている。 また，これまで見出された，分子標的候補遺伝子に関してのバリデーションおよび機能解析を順次進めているので，今年度中には数遺伝子に関しては結論を得たい。
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