研究課題
基盤研究(C)
本研究では，プラスミンによるE-カドヘリンのプロセシングが口腔扁平上皮癌の細胞増殖に影響を与えるか検討し，そのメカニズムを明らかにする．また，プラスミン阻害による癌細胞の増殖抑制効果を検索するために，α2-アンチプラスミンの遺伝子導入が扁平上皮癌の細胞増殖に与える影響について，さらに，in vivoでのα2-アンチプラスミン遺伝子導入細胞の増殖抑制効果を検討する．本研究はプラスミノ－ゲン/プラスミン系を標的とした口腔癌の増殖と浸潤・転移を阻止する新規治療法の開発に応用されると考える．
プラスミンは蛋白分解カスケードの中心的な酵素として，がんの浸潤・転移を制御している．我々は，プラスミンが，E-カドヘリンを細胞間接着活性部位で切断することで，口腔癌の細胞間接着を抑制し，細胞分散を亢進することを示してきた．さらに，プラスミン阻害物質であるα2-アンチプラスミンが口腔癌細胞の分散能を抑制することをすでに報告している．一方，これまでの研究で，扁平上皮癌細胞をプラスミンで処理することで増殖能の亢進が示唆されたが，プラスミンの癌細胞の増殖機構への関与については明らかにされていない. 本研究者は，プラスミンによるE-カドヘリンの切断により，β-カテニンが細胞膜から細胞質内に遊離・蓄積し，さらに核内移行することで，β-カテニン/TCFを介したサイクリンD1などの標的遺伝子の発現が促進され，細胞増殖を亢進していると考えている．各濃度のプラスミノーゲンを加えた培地で舌扁平上皮癌細胞株SCCKN細胞を培養し，細胞周期調節因子のサイクリンD1やc-Mycの発現をRT-PCR法で解析したところ，いずれもmRNAの亢進を認めた．SCCKN細胞を各濃度のプラスミノーゲンを含んだ培地で培養後，SCCKNの膜画分，細胞質画分および核画分におけるβ-カテニン発現をウエスタンブロット法にて解析したところ，プラスミノーゲン処理により，SCCKNのβ-カテニンは細胞質と核画分中での発現が亢進した．さらに，α2-アンチプラスミンの遺伝子導入細胞の細胞増殖能は，SCCKNと比較し低下していた．本研究はプラスミノ－ゲン/プラスミン系を標的とした口腔癌の増殖と浸潤・転移を阻止する新規治療法の開発に応用されると考える．
3: やや遅れている
プラスミノーゲン/プラスミン系が細胞増殖に与える影響を検討し，プラスミノーゲン処理によるSCCKNの，細胞周期調節因子のサイクリンD1やc-Mycの発現亢進を確認した．また，プラスミノーゲン/プラスミン系が各画分中のβ-カテニン蛋白発現に与える影響を解析し，プラスミノーゲン処理により，SCCKNのβ-カテニンは細胞膜での発現が低下し，細胞質と核画分中での発現が亢進している所見を得た．α2-アンチプラスミン遺伝子導入細胞の細胞増殖能を検討したところ，プラスミノーゲン含有の培地で培養した遺伝子導入細胞はSCCKNと比較し約1/2の低い増殖能を示した．また，遺伝子導入細胞のサイクリンD1mRNAの発現はSCCKNに比べ低下していた．α2-アンチプラスミン遺伝子導入細胞におけるβ-カテニンの局在変化を間接蛍光抗体法にて検索した．遺伝子導入細胞は，SCCKNに比べ，細胞膜でβ-カテニンの染色性が亢進し，細胞質で低下していた．α2-アンチプラスミン遺伝子導入細胞のin vivoでの増殖抑制効果の検索のため，遺伝子導入細胞をヌードマウスの背部皮下に移植している．昨年9月に本研究者が職場移動となり，研究室への往来に時間を要すようになったため進捗にやや遅れを生じている．
本研究では，プラスミンによるE-カドヘリンのプロセシングが口腔扁平上皮癌の細胞増殖に影響を与えるか検討し，そのメカニズムを明らかにする．本研究者はプラスミンによるE-カドヘリンの切断により，細胞膜から遊離したβ-カテニンが細胞質内に過剰に蓄積すると，核内に移行し，TCFと結合することで細胞増殖促進に働く遺伝子の発現を亢進し，扁平上皮癌の細胞増殖に影響を及ぼすのではと推測している．そのためTOPflash/FOPflashルシフェラーゼアッセイシステムを用いてプラスミノーゲン/プラスミン系のβ-カテニン/TCF転写活性を検索する.さらに，プラスミン阻害による癌細胞の増殖抑制効果を検索するために，in vivoでのα2-アンチプラスミン遺伝子導入細胞の増殖抑制効果を検討する．
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