| 研究課題/領域番号 |
21K10165
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分57070:成長および発育系歯学関連
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| 研究機関 | 鹿児島大学 |
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研究代表者 |
稲田 絵美 鹿児島大学, 医歯学域鹿児島大学病院, 講師 (30448568)
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| 研究分担者 |
佐藤 正宏 国立研究開発法人国立成育医療研究センター, ゲノム医療研究部, 共同研究員 (30287099)
齊藤 一誠 朝日大学, 歯学部, 教授 (90404540)
野口 洋文 琉球大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (50378733)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
完了 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2023年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2022年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2021年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
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| キーワード | 乳歯歯髄幹細胞 / 細胞工学的手法 / アルカリホスファターゼ / 多能性幹細胞 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
ヒト乳歯歯髄細胞（HDDPC）は高い増殖能と多分化能を有することが報告されており、組織再生のための有望な細胞ソースと考えられるが、非幹細胞が混在する細胞集団であるため、この中から幹細胞を純化する必要がある。申請者らの過去の研究から「アルカリホスファターゼ高活性かつOCT3/4陽性の細胞（以下、ALP(+)/OCT3/4(+)）は多能性幹細胞になり得る」と判断された。今回、細胞工学的手法によるHDDPC由来ALP(+)/OCT3/4(+)安定株樹立を目指す。同細胞の特性を解析する一方、マウス胎仔の歯槽堤部由来細胞との共培養による組織再構成実験を行い、多能性幹細胞の特性の有無を明らかにする。
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| 研究実績の概要 |
本研究では、細胞工学的手法を用い、HDDPC（ヒト乳歯由来歯髄細胞）からのアルカリフォスファターゼ（ALP）高活性かつOCT3/4陽性の細胞（以下、ALP(+)/OCT3/4(+)と表記）安定株樹立を目指す。同細胞の特性（分化多能性など）を解析する一方、マウス胎仔歯槽堤部由来細胞との共培養（器官培養）による組織再構成を行い、当該細胞の歯再生への役割を明らかにする。
始めに、HDDPCを限界希釈法で単一化cloningを行い、ALP(+)/OCT3/4(+)を単離・拡大させる試みを行ったが、全般的にclone細胞の維持・増殖は不良であった。そこで、わずかに増殖した各細胞からmRNAを回収し、少数個の細胞から遺伝子発現を解析できる全トランスクリプトーム増幅法（WTA）を用い、幹細胞特異的遺伝子の発現をRT-PCR法にて調べた。その結果、cloneによってはALP等の幹細胞特異的遺伝子の発現様式が異なることが判った。さらに、HDDPCを幹細胞様細胞に分化転換する実験も並行して進めた。具体的には、幹細胞特異的遺伝子OCT3/4を一過的に過剰発現させるために、ALP(-)HDDPC株に山中因子を繰り返し遺伝子導入した。その結果、４回目の遺伝子導入でALP(+)細胞の出現を確認した。これは、ALP(-)HDDPCがALP(+)幹細胞様細胞へ分化転換したことを示唆する。
一方、独自の器官培養系を確立すべく、細胞成長の足場となるscaffoldを検討した結果、Matrigel が細胞の3D構造構築に最適な素材と判断された。そこで、Matrigelを用いてHDDPC由来iPS細胞からの細胞分化誘導の有無を検討した結果、分化程度は低いものの三胚葉性の分化誘導が可能であることが判った。この場合、同細胞から一旦胚様体を形成させ、これを器官培養に付した場合、高度に分化した様々な細胞が誘導された。
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