| 研究課題/領域番号 |
21K10396
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分58020:衛生学および公衆衛生学分野関連:実験系を含む
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| 研究機関 | 九州保健福祉大学 |
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研究代表者 |
松葉 隆司 九州保健福祉大学, 薬学部, 教授 (20304206)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2023年度: 910千円 (直接経費: 700千円、間接経費: 210千円)
2022年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2021年度: 1,950千円 (直接経費: 1,500千円、間接経費: 450千円)
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| キーワード | 結核菌 / 病原因子 / 変異 / 抗酸菌 / 結核 / 病原性 / 機能 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
遺伝子レベルの違いによって結核菌は８つの系統株に分類されている。本研究では、これら系統株間で異なる病原性状を生み出す原因因子を遺伝子変異に着目しての探索を行い、変異による影響性を細菌、感染細胞を用いた実験で行う。具体的には、変異を持つ遺伝子と変異のない遺伝子からつくられるタンパク質を用いて、機能がわかっている場合には活性の比較、機能未知の場合には変異遺伝子をもつ菌の性状、感染細胞等の各変化を観察し、変異による影響性を明らかとし、機能推定も試みる。
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| 研究実績の概要 |
結核菌の遺伝子系統株に特異的な変異をもつ遺伝子群は、各遺伝子産物機能の活性亢進、低下あるいは機能不全が変異によって生じる可能性がある。結核菌系統株間で異なる性状を生み出す可能性ある遺伝子変異群の選抜は、全ゲノム塩基配列データベースを解析することにより行った。遺伝子配列解析により選抜した変異を持つ遺伝子と変異のない各遺伝子については、PCR法による遺伝子増幅、発現ベクターへの組み込み、組換え大腸菌作出を行ない、挿入遺伝子配列確認を行った。各組換えタンパク発現については、IPTG添加による発現誘導後の菌抽出液を、電気泳動法および目的タンパクに連結したタグに対する抗体を用いたウエスタンブロット法により確認を試みている。大腸菌組換え発現系では、可溶性だけでなく不溶性にも、選抜遺伝子多くのクローンで認められなかった。結核菌遺伝子は、GC含量高く、RNAの２次構造やアミノ酸に対応するコドン頻度など大腸菌での発現に影響を与えていると考えられたため、大腸菌で有効とされる菌株やタンパク誘導温度条件変更も行なったが、発現改善効果はこれまで得られていない。本年度実施したマイコバクテリア組換えタンパク発現系ベクターにおいても、著明な発現がタグ抗体では検出できない。マイコバクテリア発現系でのタンパク検出できない原因としては、タグ配列や付加位置による抗体反応性への影響性も考慮して今後対策を進める必要があると考えられる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
遺伝子群の選抜、遺伝子クローニングまでは順調に進んでいたが、これまでの経験と予想を上回り、選抜した結核菌遺伝子からの組換えタンパク発現誘導が困難なため。
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| 今後の研究の推進方策 |
発現ベクター・宿主、タグの種類・連結部位の変更や発現用宿主に適したコドン（塩基配列）最適化等を試みる。
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