| 研究課題/領域番号 |
21K11660
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分59040:栄養学および健康科学関連
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| 研究機関 | 松本大学 |
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研究代表者 |
山田 一哉 松本大学, 大学院 健康科学研究科, 教授 (20263238)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
3,770千円 (直接経費: 2,900千円、間接経費: 870千円)
2023年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2022年度: 1,040千円 (直接経費: 800千円、間接経費: 240千円)
2021年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
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| キーワード | SHARPファミリー / cAMP / 脂肪細胞 / 筋管細胞 / 標的遺伝子検索 / 遺伝子発現 / Forskolin / 糖新生 / PEPCK / SHARP / 時計遺伝子 / 血糖調節 / ホルモン / 臓器連関 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
本研究では、「血糖調節や健康の維持・増進における SHARP family 時計遺伝子の働きと臓器連関」について検討するために、インスリン感受性組織（肝臓・筋肉・脂肪組織）やその培養細胞系であるラット H4IIE 肝細胞、マウス C2C12筋管細胞ならびにマウス 3T3-L1脂肪細胞を用いて、cAMP やホルモンによる SHARP family 遺伝子の発現調節機構、絶食/摂食状態でアドレナリン投与や走運動させたマウスや各種の食品成分を摂食させた正常および糖尿病マウスの各組織での SHARP family 遺伝子の発現について解析する。
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| 研究実績の概要 |
本研究では、3T3-L1 脂肪細胞やC2C12筋管細胞でのcAMP シグナルによるこれらの転写因子遺伝子の調節メカニズムを明らかにするために、まず標的遺伝子の検索を行うことを目的とした。
SHARP family の標的遺伝子を検討するために、3T3-L1脂肪細胞やC2C12筋管細胞において、ドキシサイクリン存在下で SHARP family を発現誘導できる細胞システムの構築を試みた。まず、pENTR1A プラスミドにそれぞれの転写因子のcDNA を挿入した。このプラスミドとレンチウイルス発現用のCSIV-TRE-R1A-Ubc-KT プラスミドを混合し、LR clonase の存在下で相同的組み換えを起こさせて、それぞれの転写因子を発現するレンチウイルスベクターを作製した。次に、このプラスミドをレンチウイルスのエンベロープタンパク質を発現する pCMV-VSV-G-RSV-Rev プラスミドとウイルスの構造タンパク質と逆転写酵素を発現するpCAG-HIVgpプラスミドとともに、HEK293T細胞にトランスフェクションした。これらの3つのプラスミドが同時に存在する細胞からは、ドキシサイクリン存在下でのみ、それぞれの転写因子を発現するレンチウイルスが培養液中に放出される。そこで、培養上清からウイルスの遠心・濃縮を行い、3T3-L1細胞やC2C12細胞に感染させた。ウイルスが感染した細胞はピューロマイシン耐性となるため、ピューロマイシン存在下で細胞を培養・選択した。数十クローンを単離したが、不幸なことに、それらをストックしていた-80℃ディープフリーザーが故障してしまったため、すべてのクローンを廃棄せざるを得ず、遺伝子発現等を検討することができなかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
ディープフリ-ザーの故障によりせっかく得られたクローンがすべて廃棄せざるを得なくなったためである。また、身内に不幸があり、様々なことで研究に集中できなかったためである。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は、再度クローンの単離と解析を行い、RNAseqを行って標的遺伝子を同定するとともに、得られなかった場合を考えて、cAMPシグナル系によるSHARP family 遺伝子の発現誘導機構の詳細な解析を行いたいと考えている。
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