| 研究課題/領域番号 |
21K11710
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分59040:栄養学および健康科学関連
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| 研究機関 | 東邦大学 |
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研究代表者 |
高橋 良哉 東邦大学, 薬学部, 教授 (40197190)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
2,730千円 (直接経費: 2,100千円、間接経費: 630千円)
2023年度: 780千円 (直接経費: 600千円、間接経費: 180千円)
2022年度: 780千円 (直接経費: 600千円、間接経費: 180千円)
2021年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
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| キーワード | 老化 / 異常タンパク質 / プロテアソーム / タンパク質分解 / タンパク質品質管理 / プロテオスタシス / 熱ショックタンパク質 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
申請者は中高齢期からの死亡率増大とともに異常タンパク質が急増することを見出した。さらに、タンパク質管理システム自身も異常化していることを発見した。しかし、何故タンパク質品質管理システム自身の異常が修復されずに残り続けているのか不明である。加齢に伴うタンパク質品質管理システムに関わるタンパク質の活性、遺伝子発現に関する研究は世界的に行われているが、それらのタンパク質自身の異常に着目した研究は少ない。本申請では、プロテアソーム分子の異常に焦点を絞り、この分子に加齢に伴いどのようなタイプの異常が生じているのか、何故異常なプロテアソーム分子自身が分解されずに老齢組織に蓄積するのかを明らかにする。
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| 研究実績の概要 |
加齢に伴いDNA、脂質、タンパク質などの生体高分子に何らかの非生理的化学修飾を伴った異常分子が蓄積する原因のひとつとして修復酵素や分解酵素などの異常があげられる。本年度は、タンパク質品質管理システムのひとつであるプロテアソーム自身の加齢に伴う異常の原因を明らかにするために、研究実施計画の（研究１）の「加齢に伴うプロテアソームサブユニットの変化」について異なる月齢のラット肝臓を用いて等電点イムノブロット解析を行った。その結果、老齢期でC2サブユニットに複数の等電点の異なるスポットが出現することを見い出した。しかし、他の調べたプロテアソームのサブユニニットには、加齢に伴う等電点変化は認められなかった。次に、老齢ラット肝臓のプロテアソームC2サブユニットの翻訳後修飾（研究2）とプロテアソームの安定性（研究3）を調べるためにプロテアソームの精製を試みた。プロテアソームC2抗体カラムを用いて老若ラット肝臓から精製した20Sプロテアソームのサブユニット構成比に有意な違いは確認できなかった。また、プロテアソーム構成サブユニットの相対比率を複数のプロテアソーム抗体の混合液を用いたイムノブロット解析でも有意な違いは認められなかった。現在、加齢で等電点の違いが認められたC2サブユニットに加え、等電点に違いがなかったN3サブユニットなどに対するポリクローナル抗体による免疫沈降法が、それぞれのサブユニットの精製と翻訳後修飾の微量分析に有用かを検討している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
COVID-19感染拡大の影響による研究の遅れは取り戻しつつある。しかし、本学部共通装置のマルチ画像解析システムが修理不能に陥り、多くの実験が約半年間にわたり遂行できない状態が続いた。具体的には、高額なマルチ画像解析システム(約3000万円)を使用したタンパク質の二次元電気泳動によるプロファイリングや特定タンパク質の修飾を同定するための正確なイムノブロット解析、さらには二次元電気泳動ゲルからのタンパク質サンプリングの作業に多大な影響がでた。これにより、特に、研究２の実験の進捗が遅れることにより、その影響で研究3も遅れている。
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| 今後の研究の推進方策 |
研究実施計画の研究１に関しては、二次元イムノブロッティングによるC2プロファイリングが概ね終了することができた。次に、研究２のプロテアソームの翻訳後修飾については、質量分析による翻訳後修飾の解析を進めると共に、既知の異常翻訳修飾体（カルボニル化、AGE化、NO化、Met残基やCys残基の酸化など）の解析を特異的化学反応あるいは特異抗体を用いた反応を利用し解析を進める。研究3のプロテアソームの安定性の加齢変化に関する研究については、抗C2抗体を用いた精製条件を検討し、微量でも分析できる方法を模索し、実験を加速させる予定である。
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