| 研究課題/領域番号 |
21K11728
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分59040:栄養学および健康科学関連
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| 研究機関 | 京都府立医科大学 |
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研究代表者 |
松尾 和彦 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (70599753)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2023年度: 1,040千円 (直接経費: 800千円、間接経費: 240千円)
2022年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2021年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
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| キーワード | 一次線毛 / 中心体 / 血管内皮 / 血管老化 / 細胞分裂 / ES細胞 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
初年度は、①PCNTと相互作用する分子を探索する為に、ビオチン化酵素をPCNTのアミノ末端に付加するように遺伝子編集を行ったES細胞を樹立し、この細胞にビオチンを添加してビオチン化された蛋白質の同定を行う。また、PCNTの遺伝子破壊された血管内皮細胞では細胞老化が進行している可能性が考えられる為、②PCNT遺伝子を破壊したES細胞を樹立し、血管内皮細胞へと分化させた後、遺伝子発現の解析を行い、PCNTが担うシグナル経路の解析を行う。さらに、③血管内皮特異的にPCNTを遺伝子破壊したマウスを作製する。次年度以降は、初年度に行った研究データの解析、及び作成した遺伝子破壊マウスの表現型の解析を行う。
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| 研究実績の概要 |
本研究課題は 、 「 １．血管内皮細胞においてPCNTと相互作用する分子の 探索」 、 「 ２．PCNTが血管内皮細胞で担うシグナルの解析」 、 「 ３．PcntコンディショナルKOマウスの作製」の３つの研究計画で構成されている。
「 血管内皮細胞におけるPCNTと相互作用する分子の探索」に関して、 以前おこなった解析によりPCNTと相互作用する候補タンパク質をいくつか同定できている。昨年度は 培養細胞を用いた強制発現系を使って同定した候補タンパク質とPCNTとの相互作用について検討をおこない、このうちのいくつかは相互作用することを見出した。本年度は、一次線毛を形成させた条件で内在性のタンパク質同士の相互作用について検討を行た。強制発現系では相互作用していた分子も内在性のタンパク質同士の相互作用を見出すことができなかった。現在は、相互作用解析で同定されたPCNT結合タンパク質のうち、未解析のタンパク質に関してPCNTとの相互作用を検討している。
「PCNTが血管内皮細胞で担うシグナルの解析」に関しては、マウスES細胞を使ってPCNTのノックアウト細胞を樹立した。本年度はこの細胞を使って血管内皮細胞を分化誘導し、分化させた細胞の表現型解析や遺伝子発現解析を行う予定であった。しかし、ES細胞から効率よく血管内皮細胞への分化誘導ができず、現在は野生型マウスES細胞を使って高効率な血管内皮細胞への分化誘導系の確立を目指している。
「PcntコンディショナルKOマウスの作製」に関しては、新たなES細胞を用いてコンディショナルアレルを有する細胞を樹立し、キメラマウスの作製はできたが、マウスへの寄与率が低く未だキメラマウスが樹立できていない。現在は別のデザインのコンディショナル標的アレルを持つES細胞の樹立も並行して行っている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
「 血管内皮細胞におけるPCNTと相互作用する分子の探索」に関して、本年度は一次線毛を形成させた条件で内在性のタンパク質同士の相互作用について検討を行た。上記の通り強制発現系では相互作用していた分子も内在性の相互作用を見出すことができなかった為、相互作用解析で同定されたPCNT結合タンパク質のうち、未解析のタンパク質に関してPCNTとの相互作用を検討している。
「PCNTが血管内皮細胞で担うシグナルの解析」に関しては、当初の予定とは異なり、ES細胞からの高効率な血管内皮細胞への分化誘導系ができていない。現在は野生型マウスES細胞を使って高効率な血管内皮細胞への分化誘導系の確率を目指しており、この系が確立でき次第、更なる解析を進める。
「PcntコンディショナルKOマウスの作製」に関しては、新たなES細胞を用いてコンディショナルアレルを有する細胞を樹立し、キメラマウスの作製はできたが、未だキメラマウスが樹立にまで至っていない。この為、当初の予定よりも解析が遅れている。
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| 今後の研究の推進方策 |
「 血管内皮細胞におけるPCNTと相互作用する分子の探索」に関しては、相互作用解析で同定されたPCNT結合タンパク質のうち、未解析のタンパク質に関してPCNTとの相互作用について検討をおこなう。同時に、一次線毛や基底小体への局在についても免疫蛍光染色にて検討を行う。
「PCNTが血管内皮細胞で担うシグナルの解析」に関しては、ES細胞からの高効率な血管内皮細胞への分化誘導系の確立を目指しており、この系が確立でき次第、更なる解析を進める。
「PcntコンディショナルKOマウスの作製」に関しては、新たなES細胞を用いてコンディショナルアレルを有する細胞を樹立しており、引き続きキメラマウスの作製を試みる。血管内皮細胞への分化誘導が安定に行えるようになれば、PcntコンディショナルKO細胞を用いて血管内皮への影響を検討する。
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