| 研究課題/領域番号 |
21K12220
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分63010:環境動態解析関連
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| 研究機関 | 静岡大学 |
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研究代表者 |
藤原 健智 静岡大学, 創造科学技術大学院, 教授 (80209121)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2023年度: 1,040千円 (直接経費: 800千円、間接経費: 240千円)
2022年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
2021年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
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| キーワード | 従属栄養硝化 / ピルビン酸オキシム酸素添加酵素 / POD |
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| 研究開始時の研究の概要 |
従属栄養微生物による環境中の硝化作用への寄与は、独立栄養性の硝化菌と同等、あるいはそれ以上に大きいと考えられている。独立栄養硝化がエネルギー産生と共役する異化的作用であるのに対し、従属栄養硝化のプロセスはエネルギーの消費しかもたらさない。従属栄養硝化を行うことが微生物自身にとってどのようなメリットがあるのか？、という根本的な問いに答え得る仮説を検証することで、従属栄養硝化に関する微生物生態学やその応用研究を発展させるために必要となる、明確な生化学的基盤を与える。さらにその仮説に基づいて農薬を用いない硝化抑制の可能性についても検討する。
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| 研究実績の概要 |
１．Alcaligenes faecalis由来のピルビン酸オキシム酸素添加酵素（AfPOD）の結晶化と凍結を嫌気チャンバー中で行い、BL-1Aビームライン（KEK-PF）で取得したＸ線回折データを用いることで、AfPODの二価鉄結合状態の結晶構造を1.7Å分解能で得ることに成功した（PDB ID: 8IL8）。またAfPODの活性に必須であるN末端18アミノ酸残基を欠損した変異酵素（AfPODd18N, PDB ID: 8IQA）、およびBradyrhizobium sp. WSM3983由来のPOD（BWPOD, PDB ID: 8IX6）についてもそれぞれ結晶構造を解析した。現在は、PODの結晶構造、および反応機構に関する学術論文を作成中である。
２．アミノ酸配列に基づく分子系統解析、および機能分析の結果、PODはクラスⅡアルドラーゼ・スーパーファミリーに属する他の酵素タンパク質とは明確に区別される単系統群であることを示した。またPOD遺伝子は、芳香族化合物の代謝や輸送に関与すると考えられる遺伝子と同一の転写単位を構成する。このことからPODは、従属栄養硝化とともに、何らかの代謝経路にも関与する‘ダブルファンクション’酵素である可能性がある。この仮説に関する学術論文を投稿した（査読中）。
３．A. faecalisのPOD遺伝子破壊（dpod）株の作成に成功し、遺伝子破壊によって従属栄養硝化能を失うことを確認した。さらにdpod株と親株を用いてメタボロム解析を行った結果、ポリアミンの一種であるスペルミジンがdpod株では検出されなくなることから、PODが従属栄養硝化だけでなく、ポリアミン代謝にも関与している可能性が示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
活性型である二価鉄結合状態のAfPODの結晶構造が高分解能で得られ、活性中心の構造を明らかにすることはできたものの、基質（ピルビン酸オキシム）あるいは阻害剤（ピコリン酸）の結合状態の構造がまだ得られていないため、強い根拠に基づいて反応機構を深く議論することは現状では難しい。また、上記実績の２はまだ論文の採択に至っていない。さらに上記実績の３にあるように当初の計画通りメタボロム分析を行い、興味深い結果は得られているものの、分析条件の最適化等を行う必要があるなど、最終年度に向けて解決すべき課題が残っている。以上を総合し、研究開始２年目の進捗状況は「おおむね順調」とした。
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| 今後の研究の推進方策 |
最終年度の研究計画は以下のとおりである。
１．これまではPOD活性を拮抗的に阻害するピコリン酸（ピリジン-2-カルボン酸）やその誘導体との結合型の結晶化と構造解析を進めて来たが思わしい結果は得られていない。そこで今年度は、AfPODの基質（ピルビン酸オキシム）結合状態の結晶構造の解析を試みる。基質分子が結合した状態の活性中心の構造を明らかにすることによって、POD反応の分子機構の解明のみならず、POD阻害剤、すなわち従属栄養硝化をターゲットとする新規硝化抑制剤の分子設計に向けた重要な情報が得られるものと期待している。
２．実績概要２，３に、PODは従属栄養硝化とともになんらかの代謝経路に関与している可能性があり、その候補の一つとしてポリアミン代謝が考えられることを述べた。また一昨年度の成果として、PODの遺伝子を破壊した放線菌Streptomyces rubrolavendulaeでは気菌糸形成が促進されることを見出している（2021年学会発表）。本研究計画の目的である、PODの‘真’の機能の解明に向け、「ポリアミン代謝」および「放線菌の気菌糸形成」とPODとの関係について分析を進める。前者についてはA.faecalisのdpod株と親株を用いてポリアミンの分析と培養に伴う経時的変化を、また後者については、S. rubrolavendulaeのdpod株と親株を用いてPOD欠損あるいは活性阻害の気菌糸形成への影響を定量的に分析するとともに、この菌種についてもポリアミンの分析を行う。
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