| 研究課題/領域番号 |
21K12263
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分63030:化学物質影響関連
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| 研究機関 | 国立医薬品食品衛生研究所 |
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研究代表者 |
安井 学 国立医薬品食品衛生研究所, 変異遺伝部, 室長 (50435707)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)
2023年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
2022年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
2021年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
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| キーワード | DNA付加体 / 代謝活性化 / 薬物代謝酵素 / S9 / 変異原性物質 / 薬物代謝 / in vitro / 遺伝毒性 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
遺伝毒性物質には、直接変異原性物質と間接変異原性物質がある。前者は、それ自身が化学的に高い反応性を持つため、DNA塩基と試験管内で反応させると、未知のDNA損傷を含めて多種多様なDNA損傷ピークをHPLC等で検出できる。一方、後者はDNAと反応する前に薬物代謝酵素による活性化を必要とし、試験管内で未知のDNA損傷を検出できるシンプルなDNA損傷分析系はいまだに確立されていない。本研究は、ラット肝S9酵素画分を透析膜内に入れ、その膜内で間接変異原性物質を代謝活性化させた後で、DNA塩基と反応させる新しい代謝活性化系をまず構築し、その損傷形成の収率が高い場合は新規DNA損傷として構造決定を試みる。
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| 研究実績の概要 |
変異原性物質（4種）、ラット肝S9、核酸塩基dNの各最適濃度、およびHPLC分離条件の最適化について、様々な実験より得られたデータから反応系の条件をほぼ決定した。しかしながら、現段階において、DNA付加体と予想される候補のHPLCピーク面積は非常に小さく、収率は高くないことが分かった。そこで、各変異原性物質のDNA付加体を効率良く形成させるために、S9に含有する第Ⅱ相薬物代謝酵素（硫酸転移酵素など）を機能させるアプローチを考えた。その予備実験として、まず、簡易に実行できるin vitro小核試験法を使って、S9 mix存在下でPAPS（3'-ホスホアデノシン-5'-ホスホ硫酸）補因子を補充し、S9中の硫酸転移酵素が正しく機能するかを確認した。その際の間接変異原物質は、第Ⅰ相代謝反応後に第Ⅱ相反応で硫酸抱合体を形成するとされているアリストロキア酸を用いた。その結果、PAPS補充群の小核形成頻度は、そのPAPS非補充群のそれよりも高い遺伝毒性を示した。つまり、アリストロキア酸は、硫酸抱合体を介することで、より効率良くDNA付加体を増加させたと考えられた。今後、このアリストロキア酸のDNA付加体形成能を確認できたPAPS補充型in vitro小核試験と同じ条件下で、透析膜を使ったDNA付加体形成実験を実施する予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
透析膜を利用する試験管内反応において様々な条件下で実験を実施したこと、および第Ⅰ相だけでなく第Ⅱ相薬物代謝反応を利用したアプローチで、補因子補充型のin vitro小核試験法を一部確立した。以上のことから、S9存在下における試験管内のDNA付加体形成の研究が着実に進展している。
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| 今後の研究の推進方策 |
研究を進めていくと、予想以上にHPLC（PDA検出器）ではDNA付加体の形成能を検出できないオーダーであることが分かってきた。質量分析装置を利用するなどいくつか方策が考えられたが、まずは、各変異原性物質のDNA付加体を効率良く形成させるため、また、in vitro代謝系の研究推進のために、S9に含有する第Ⅱ相薬物代謝酵素（硫酸転移酵素など）を機能させるアプローチを選択した。第Ⅱ相代謝酵素がワークできる条件を明確にするために、DNA付加体形成とも相関関係にあるin vitro小核試験をエンドポイントとして使う。
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