| 研究課題/領域番号 |
21K12341
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分64050:循環型社会システム関連
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| 研究機関 | 中部大学 |
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研究代表者 |
宮田 茂 中部大学, 応用生物学部, 准教授 (90314913)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)
2023年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
2022年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
2021年度: 1,950千円 (直接経費: 1,500千円、間接経費: 450千円)
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| キーワード | Clostridium perfringens / ウェルシュ菌 / 水素 / 代謝工学 / ゲノム編集 / バイオマス |
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| 研究開始時の研究の概要 |
ウェルシュ菌は嫌気要求度の低い偏性嫌気性菌で、現在知られている細菌のなかで最も速い増殖速度を示す細菌の一種である。旺盛な有機物分解能を有し、生育に伴い大量の水素を産生するが、セルロース資化性やトリアシルグリセロール分解能は有していない。本研究ではゲノム編集によりウェルシュ菌染色体を改変し、水素生産に関わる代謝系を構成する遺伝子の欠失及び挿入により水素生産性の向上を試みる。さらに、他菌種のセルラーゼ遺伝子等を染色体に挿入し、効率的にセルロースやヘミセルロース等のセルロース系バイオマスを資化できる株を構築する。同様に脂質代謝を改善し、各種バイオマス利用能を付加した高度水素生産株の構築を目指す。
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| 研究実績の概要 |
ウェルシュ菌は嫌気要求度の低い偏性嫌気性菌で、現在知られている細菌のなかで最も速い増殖速度を示す水素生産菌の一種である。本研究では、ゲノム編集によりウェルシュ菌染色体を改変し、水素生産に関わる代謝系を構成する遺伝子の欠失及び挿入により水素生産性の向上を試みた。加えて、廃棄物系バイオマスからの水素生産も目指している。昨年度、グルコース含有培地を用いた場合、ldhL、ldhD、adhEの三重欠失株が最も高い水素産生量を示すことを明らかにした。また、グリセロール含有培地では、pduCDEの欠失により、増殖がグルコース含有培地なみに改善し、水素生産量が大幅に向上することを明らかにした。
今年度は、グルコース含有培地でもグリセロール含有培地でも、効率よく増殖し、高い水素生産性を示す株の構築を目指して、上記4遺伝子を欠失させた多重欠失株を構築した。その結果、グルコース含有培地では親株と比較して増殖に大きな差はみられなかったが、予想に反してグリセロール含有培地では大きく増殖が抑制された。ガスクロマトグラフィーを用いて、代謝産物を調べた結果、pduCDE単独欠失株では、グリセロールからエタノールに代謝される割合が多かったが、四重欠失株では、酪酸に代謝される割合が多かった。そのため、酪酸合成の初発酵素遺伝子であるatoBを欠失させ、理論上、水素生産に有利な酢酸合成に代謝を変化させようと試みたが、グリセロール含有培地でもグルコース含有培地でも増殖が抑制された。アセチルCoAから酢酸に代謝する酵素の反応速度が遅いか何らかの制御機構の存在が示唆された。他のClostridium属の酢酸合成遺伝子を高発現させるために、ウェルシュ菌で機能する構成的発現系の構築に成功した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究では、セルロース系バイオマスや廃食油等の未（低）利用バイオマスから効率的に水素を生産可能な菌株を構築することを目的として、ゲノム編集によりウェルシュ菌の染色体を改変し、水素生産性に及ぼす効果を明らかにすることを目指している。当初から計画どおり研究が進まないことを考慮して、各課題を並行して進めることができるように研究を計画している。
2022年度は、グルコース含有培地でもグリセロール含有培地でも、効率よく増殖し、高い水素生産性を示す株の構築を目指して、それぞれの培地でよく増殖し、高い水素生産性を示す4遺伝子を欠失させた多重欠失株を構築したが、予想に反してグリセロール含有培地での増殖が抑制された。一方で、ウェルシュ菌で機能する構成的発現系の構築に成功した。その過程で、ε毒素プロモーターの性質を明らかにした。それらのことから、全体的にはおおむね順調に進展していると考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
引き続き、水素生産量が最大になる遺伝子欠失及び補充の組合せを明らかにする。また、ウェルシュ菌で高発現するセルラーゼ／ヘミセルラーゼやリパーゼの選別と非資化性糖の代謝経路を構成する遺伝子群の遺伝子補充を行い、代謝系の付与を試みる。
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