| 研究課題/領域番号 |
21K12767
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分90140:医療技術評価学関連
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| 研究機関 | 国立医薬品食品衛生研究所 |
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研究代表者 |
草川 森士 国立医薬品食品衛生研究所, 再生・細胞医療製品部, 主任研究官 (80462802)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2023年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2022年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2021年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
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| キーワード | 間葉系幹細胞 / T細胞 / 混合リンパ球反応（MLR） / 混合リンパ球反応試験（MLR） / GVHD / 間葉系幹細胞（MSC） |
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| 研究開始時の研究の概要 |
重症急性移植片対宿主病（GVHD）の治療に用いられる間葉系幹細胞（MSC）の有効性（免疫抑制能）を高精度に評価するための新規バイオアッセイ法の確立を目的とし、混合リンパ球反応（MLR）試験の改良に取り組む。具体的には、①MLR試験に利用可能なモデル細胞（ポジコンとなる被検細胞モデル、T細胞モデル）のスクリーニング、②簡便な三次元共培養系のMLR試験への応用、③イメージングによるMLR試験の評価技術の実行可能性の検討を実施する。さらに、GVHDへの効果が確認されているMSCについて、新規MLR試験法を用いた免疫抑制能の評価を実施し、確立した試験法の有用性／妥当性の検証を行う。
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| 研究実績の概要 |
MLR試験での利用を想定したモデル細胞のスクリーニングを引き続き実施した。免疫応答を示すT細胞モデルとして、TALL-とMOLT-4を選定した。これらの細胞株はマイトジェンによる活性化反応を安定して示すことが見出された。並行して、MLR試験における被験細胞モデルの評価を行った。従来法MLRにて、MRC-5と不死化MSCがPBMCの増殖を抑制することを確認した。複数のPBMCロットへの影響を検討した結果、不死化MSCが安定してPBMCの増殖を抑えることが分かり、MLRにおけるポジコンとして有用であることが見出された。
続いて、MLR試験における培養法の改良として、細胞を分散させるポリマー試薬を添加した培地と低接着容器を用いて構築される３次元環境下での細胞培養を検討した。ポリマー試薬の添加濃度、培養細胞の密度などの条件検討を実施した。
さらに、MLR試験をイメージング技術によって定量的に評価する方法を検討した。TALL-1とMOLT-4それぞれに、増殖マーカーとして知られる細胞周期関連遺伝子のプロモーターとGFP遺伝子のノックインを施し、遺伝子改変細胞株を複数樹立した。さらに、遺伝子改変細胞株の特性解析を進め、ノックイン株において、細胞増殖・分裂に伴い、蛍光タンパク質が発現することを確認した。また、これら遺伝子改変細胞株を用い、シングルセルレベルで細胞を撮像するための培養容器の検討、撮像方法の検討、画像解析の検討も進めた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
概ね予定していたことは実施できたが、遺伝子改変細胞株（T細胞モデル）の樹立と特性解析にかなり時間を要してしまい、従来法を含むMLRにおける有用性評価を実施することができなかった。また、TALL-1とMOLT-4は、マイトジェンによる活性化反応を示す一方で、増殖亢進反応はごく一過性であることが明らかとなっており、従来法MLRで用いているPBMCとの同等性が気になるところである。新規バイオアッセイ法をある程度のところまで確立しておきたかったが、まだ各要素の改良だけに留まり、それらを融合させた場合の条件検討を早く進めなければならない。
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| 今後の研究の推進方策 |
令和5年度は、従来MLR法に替わる新規MLR法を確立し、有用性／妥当性の検証を実施する。具体的には、培養系として、簡便な3次元培養技術を取り入れた共培養法の条件を確立する。さらに、解析系として、細胞数や各細胞の特徴量を画像解析によって効率的に評価する方法を確立する。これらを融合させた新規バイオアッセイについて、モデル細胞株、複数のMSCロットを用い評価／検証を進める予定である。
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