研究課題/領域番号 |
21K14027
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研究種目 |
若手研究
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配分区分 | 基金 |
審査区分 |
小区分17050:地球生命科学関連
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研究機関 | 琉球大学 (2022) 筑波大学 (2021) |
研究代表者 |
磯和 幸延 琉球大学, 熱帯生物圏研究センター, 特命助教 (70782572)
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研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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配分額 *注記 |
4,550千円 (直接経費: 3,500千円、間接経費: 1,050千円)
2024年度: 1,040千円 (直接経費: 800千円、間接経費: 240千円)
2023年度: 910千円 (直接経費: 700千円、間接経費: 210千円)
2022年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2021年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
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キーワード | 腕足動物 / 殻体タンパク質 / 化石タンパク質 / ELISA / ICP-1 / タテスジホウズキガイ / プロテオーム |
研究開始時の研究の概要 |
骨や貝殻などの硬組織中に含まれるDNAやタンパク質は化石として保存され、その配列を決定することで過去の生物の遺伝情報を復元することができる。化石タンパク質の配列を決定する研究は主に脊椎動物で多く行われており、より豊富で、連続的に化石が産出する無脊椎動物を用いた研究例は少ない。本研究では、約100万年間にわたり、連続的に産出する腕足動物の化石からタンパク質を抽出し、そのアミノ酸配列を複数の年代において決定することを目的とする。その後、現生種から得られた殻体タンパク質のデータに化石タンパク質のデータを加えて、時間軸に沿って連続的に比較することにより、分子進化プロセスを直接的に議論することを目指す。
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研究実績の概要 |
本研究は腕足動物の化石中に含まれる殻体タンパク質を同定し、過去の遺伝情報を復元し、比較することで、分子進化プロセスを直接観察することを目指している。本年度は、現生種の腕足動物を採集する目的で、10月に東京大学大気海洋研究所大槌研究センターを訪れ、船舶から採泥器を用いた腕足動物の採集を行った。その結果、Lingula sp.を4個体、採集することに成功し、殻形成組織である外套膜はRNAlaterに保存し、他の組織と殻はエタノール保存した。また、本年度は主に昨年度に購入したマイクロプレートリーダーを用いて、ELISA法により化石中に殻体タンパク質のアミノ酸配列が分解されずに保存されているか検証する実験を行った。研究代表者は先行研究において、嘴殻亜門に属する腕足動物の1種であるホウズキチョウチンガイ(Laqueus rubellus)から殻体タンパク質の1種であるICP-1の全長配列を決定し、質量分析計によるペプチド配列の検出数から、ICP-1が殻体中に最も多く存在することを示した。その後、その配列情報をもとにICP-1に特異的に結合する抗体を作成した。本年度行った実験ではホウズキチョウチンガイの近縁種であるタテスジホウズキガイ(Coptothyris grayi)の現生サンプルと化石サンプルを用いて、殻体タンパク質を抽出した後、ICP-1抗体を用いてELISA法によりその反応を検出した。現在のところ、ネガティブコントロールの反応が強く検出されるため、化石中のICP-1の反応を正確に評価することはできてはいないが、今後、抗体の濃度の検討などを行い、化石タンパク質に対する続成作用の影響を確認するための実験環境を確立することを目指す。
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現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
昨年度は主にタテスジホウズキガイの現生サンプルについて、質量分析計を用いて殻体タンパク質の網羅的な同定を行う解析を行ったが、本年度は昨年度購入したマイクロプレートリーダーを用いて、タテスジホウズキガイの化石サンプルにおける殻体タンパク質の保存の状況を確認するために、ICP-1抗体を用いたELISA法による解析を行った。これにより、現生サンプルの解析だけでなく化石サンプルの解析に着手することができ、研究の進捗としては、次の段階に進むことができたといえる。また、現生サンプルの解析についても、新しい腕足動物種のサンプルを得るために東京大学大気海洋研究所大槌研究センターにおいてサンプリングを行った。当初、想定していた嘴殻亜門に属する種のサンプリングはできなかったが、舌殻殻門に属するLingula sp.のサンプリングに成功し、本研究の新たな展開に利用できる可能性がある。一方で、今年度は昨年度まで所属していた筑波大学下田臨海実験センターから琉球大学熱帯生物圏研究センター西表研究施設に所属が移動し、実験環境の立ち上げに多少時間を要したこともあり、当初予定していた殻体タンパク質抗体を用いた化石タンパク質の存在を確認するための実験環境を確立することができていない。また、本年度は化石種のサンプルについても質量分析計を用いてアミノ酸配列の決定を行うことを予定していため、その点に関しても計画に若干の遅れが生じている。ただし、現生及び化石サンプルからのタンパク質の抽出実験は現在の研究環境で確立できており、来年度以降、配列決定の解析にも着手することを予定している。
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今後の研究の推進方策 |
来年度も現在、行っているICP-1抗体を用いたELISA法による化石サンプル中の殻体タンパク質の保存状態の評価を継続して行う。これにより、化石中に確実に殻体タンパク質のアミノ酸配列が保存されていることを確認する。また、ウエスタンブロッティングを行い、先行研究において作製した抗体がICP-1と特異的に結合することも確認する予定である。これらの実験と並行して、来年度は質量分析計を用いた化石タンパク質の配列決定の解析にも取り組む予定である。現在、解析に用いているホウズキチョウチンガイ、タテスジホウズキガイの化石サンプルは採集済みであるが、房総半島の地層にて追加のサンプル採集を行う予定である。その後、EDTAを用いて、化石サンプルを脱灰し、化石タンパク質の抽出作業を進める。得られた化石抽出物についてICP-1抗体を用いて続成作用の程度を確認した後、質量分析計によるアミノ酸配列の決定を受託解析サービスにより行う予定である。また、来年度からは近縁種であるコカメガイ(Pictothyris picta)及びカメホウズキチョウチン(Terebratalia coreanica)も解析に用いることを予定しており、現生サンプルの採集、現生サンプルからの殻体タンパク質の同定、抗体を用いた化石中のタンパク質の保存状態の確認、化石サンプルにおける殻体タンパク質のアミノ酸配列の決定を順次、進める予定である。その後、配列が得られ次第、時間軸にそった殻体タンパク質の配列の比較を行う。
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