研究課題/領域番号 |
21K14750
|
研究種目 |
若手研究
|
配分区分 | 基金 |
審査区分 |
小区分37030:ケミカルバイオロジー関連
|
研究機関 | 名古屋大学 |
研究代表者 |
平岡 陽花 名古屋大学, 理学研究科, 特任助教 (70880053)
|
研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
|
研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
|
配分額 *注記 |
4,420千円 (直接経費: 3,400千円、間接経費: 1,020千円)
2023年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
2022年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2021年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
|
キーワード | 膜透過性核酸 / ジスルフィド修飾 / 遺伝子抑制 / 核酸医薬 / 化学修飾核酸 / 細胞膜透過 / スプライシング制御 / 核酸デリバリー / 化学修飾 / イメージング |
研究開始時の研究の概要 |
本研究では、超高速に膜透過する修飾核酸の動態解析および最適化に取り組む。 近年、遺伝子疾患の治療法として核酸医薬が注目されているが、細胞膜透過性の低さのため運用が制限されている。申請者の研究室では、核酸にチオール基を含む修飾構造を付加することで僅か10分で自発的に細胞内に導入されることを見出した。時間経過に伴う核移行も見られており、細胞質および細胞核の多様な分子を標的にできる。しかしその過程の多くが未解明であり、厳密な機能制御に至っていない。過程を理解しメカニズムに基づいて修飾を最適化することで、膜透過および核移行の制御が可能となり、任意の場所で機能する核酸医薬品の開発に繋がると期待される。
|
研究実績の概要 |
本年度は、当研究室で開発した膜透過性核酸MPON(Membrane Permeable OligoNucleotide)の (A) 細胞内動態観察 と (B) 新規膜透過性核酸の開発 に取り組んだ。MPONはアンチセンスDNAあるいはsiRNAなど標的遺伝子の発現抑制に用いられる核酸材料に対してジスルフィド修飾を施した化学修飾核酸を指す。(A)について、蛍光標識したMPONをヒト培養細胞であるHeLa細胞に投与し、共焦点蛍光顕微鏡を用いて観察したところ、一部の細胞において、細胞内で局所的に凝集している様が見られた。ここで用いた第一世代と呼称するMPONに付加した化学修飾基は高い疎水性を有しており、それが細胞内での核酸凝集を促している可能性が考えられた。凝集が見られた細胞は一部であったが、凝集によって、見かけの核酸濃度低下に伴う機能低下や細胞への悪影響が起こる可能性が危惧された。そのリスクを回避するために、疎水性を低下させた修飾基や、細胞内の還元的環境に応答して修飾が外れる脱離型の修飾基などを付加した、新しい膜透過性核酸の開発に取り組んだ (B)。疎水性を低下させた修飾基の開発について、候補として合成したいくつかの修飾核酸について、膜透過性効率および遺伝子抑制効果を評価した。効果を示す修飾核酸が得られつつある一方で、第一世代MPONを上回るものは未だ得られていないため、引き続き開発を進める。また、膜透過ののち細胞内で脱離するよう、開裂構造を挿入した修飾基を考案し合成した。細胞内の還元的環境で開裂するようなジスルフィドリンカーを挿入したものや、細胞内で不安定で切断されやすいRNA配列を挿入したものなどを合成しており、現在、膜透過効率、遺伝子抑制効果、脱離効率などの面で評価を進めている。
|
現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究のステップとして、先立って開発した膜透過性核酸MPONの ①細胞膜透過のメカニズム解明 ②核移行プロセスの解明 に取り組み、③ 機能制御可能な修飾核酸の開発 を目指していた。昨年度までに①と②に関連した実験を行い、論文として報告した。今年度は、②と③に主に取り組んだ。 ②について、MPONが投与後4-5分程度で細胞内に導入されること、その後48-72時間で核移行することを昨年度までに示していた。しかしMPONが数分以内に細胞内に導入されているのに対して核移行が見られたタイミングが非常に遅く、蛍光ラベルしたMPONの細胞内動態をより詳細に観察したところ、一部の細胞で局所的な蛍光集積が見られることが分かった。ここで用いた第一世代MPONが有する高い疎水性によって核酸が凝集していることが原因と思われたので、疏水性を低下させたMPONをいくつか考案し、膜透過性効率および遺伝子抑制効果を評価した。効果を示す修飾核酸が得られつつある一方で、第一世代MPONを上回るものは未だ得られていないため、引き続き開発と評価を進める。また、③とも関連して、膜透過ののち細胞内で脱離することで、凝集のリスクをなくすと同時に速やかに核移行できる修飾核酸の開発を目指した。細胞内の還元的環境で開裂するようなジスルフィドリンカーや、細胞内で不安定で切断されやすいRNA配列などの開裂構造を挿入した核酸を合成しており、現在、膜透過効率、遺伝子抑制効果、脱離効率などの面で評価を進めている。 MPONの細胞内動態の観察を進めており、その観察結果に基づいて新規修飾核酸を複数考案し合成した。さらにその中から有望な新規修飾核酸が得られつつあるため、「おおむね順調に進展している」と評価した。
|
今後の研究の推進方策 |
今後は主にステップ③の機能制御可能な修飾核酸の開発に取り組む。細胞内での修飾基の脱離を目指して合成した、ジスルフィドリンカーやRNA配列などの開裂構造を挿入したMPONについて、膜透過効率、遺伝子抑制効果、脱離効率の評価を進める。これによって、細胞内凝集を防ぐと同時に、速やかに核移行可能なMPONの開発を目指す。核移行を促す方法として、トリメチルグアノシン (TMG) キャップを付加した核酸の合成も検討している。TMGキャップは核内スプライシングに関与するsnRNAによく見られる5’キャップ構造であり、付加することで核移行を促進するとされる。既存のMPONにTMGキャップを付加することで、速やかな核移行が可能となるか調べる。 疎水性の低下による凝集の抑制にも引き続き取り組む。これまでは、合成収率向上のため、修飾基の導入数が少なくても効果があるものに絞って探索していたが、現状では第一世代MPONを上回る効果が得られていないため、導入数を増やすことも検討する。将来的な産業化も視野に入れ、効果の高さと合成の容易さの両方を満たす修飾核酸の開発に尽力する。
|