| 研究課題/領域番号 |
21K14860
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| 研究種目 |
若手研究
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| 配分区分 | 基金 |
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| 審査区分 |
小区分39050:昆虫科学関連
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| 研究機関 | 金沢大学 |
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研究代表者 |
國生 龍平 金沢大学, 生命理工学系, 博士研究員 (90756537)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円)
2023年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
2022年度: 1,040千円 (直接経費: 800千円、間接経費: 240千円)
2021年度: 2,080千円 (直接経費: 1,600千円、間接経費: 480千円)
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| キーワード | カイコ / バキュロウイルス / 宿主行動操作 / T3up1 / ノックイン / 行動操作 / コンディショナルノックアウト |
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| 研究開始時の研究の概要 |
自然界では、病原体や寄生生物が宿主の行動を操る現象がしばしば見られる。しかし、彼らがどうやって行動を操るのか、その仕組みには謎が多く残されている。申請者は行動操作のモデルケースとして、バキュロウイルスとその宿主であるチョウ目昆虫を材料に研究を進めてきた。その結果、バキュロウイルスが宿主昆虫の脳に感染し、ある宿主遺伝子（T3up1）を自分のために利用している可能性が浮上した。そこで、本研究課題ではコンディショナルノックアウト技術をカイコに導入することで、このT3up1遺伝子がもともとカイコでどのような用途で使われており、それをウイルスがどのように制御しているかを明らかにしたいと考えている。
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| 研究実績の概要 |
病原体や寄生生物による宿主行動の利己的な操作は自然界で普遍的に見られる現象だが、その詳細なメカニズムには未解明の謎が多く残されている。申請者は行動操作のモデルケースとして、バキュロウイルスとその宿主であるチョウ目昆虫を材料に研究を進めてきた。その結果、バキュロウイルスは宿主昆虫の脳に感染し、ある宿主遺伝子（T3up1）の発現を上昇させることで脳の行動制御中枢の活性を操っている可能性が示唆された。そこで、本研究課題では宿主昆虫におけるT3up1の本来の機能を明らかにし、バキュロウイルスによるT3up1発現操作の具体的な分子メカニズムに迫ることを目標とする。
令和４年度は、前年度に作出したT3up1ノックアウトカイコ系統（T3up1KO系統）の性状解析を行った。その結果、T3up1KO系統はホモ致死であり、KOホモ個体は大多数が催青後に孵化できないこと、そして孵化した個体も餌を摂食せずに致死することが判明した。したがってT3up1は孵化や摂食といった行動の活性に必須であると考えられるが、ホモ致死や摂食しないという性質上、残念ながらウイルス感染実験は不可能であると結論づけた。また、前年度に作出したT3up1-2A-Gal4カイコ系統をUAS-蛍光タンパク質系統と交配し、F1個体を用いてT3up1発現細胞を蛍光タンパク質でラベルした。その結果、摂食期のカイコ幼虫ではT3up1は腸管血体腔側に散在する細胞（神経細胞と思われる）や触角基部の細胞で発現していること、そしてウイルス感染時は脳や食道下神経節の一部の領域の細胞において発現することが明らかになった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
昨年度の最も重要な進展は、インフレームでの遺伝子ノックインにより作出したT3up1-2A-Gal4カイコ系統を用いてT3up1発現細胞を蛍光タンパク質でラベルすることで、T3up1がどの組織の・どの部位で・どのような種類の細胞で発現しているかを明らかにしたことである。また、T3up1ノックアウトカイコの性状解析を行ったことで、ウイルス非感染時におけるT3up1の生体機能に関する基本的な実験データを収集することができた。これらの結果からT3up1の作用機序についてより具体的な仮説へと更新できたことは、次年度の研究進展に大きく寄与するものであると考えている。一方、当初計画していたコンディショナルノックアウトカイコに関しては、ヒートショックプロモーターを用いた部位特異的遺伝子発現系が当初想定したようには機能しないことが判明したため、次年度はT3up1-2A-Gal4カイコを用いた解析をメインに据える予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
次年度はまず、作出した抗T3UP1ペプチド抗体を用いたウエスタンブロッティングや免疫染色実験を行うことで、T3UP1タンパク質の発現細胞や発現時期について詳細なプロファイルを調査する。同様に、T3up1 mRNA発現についてはin situハイブリダイゼーション法での検出が不可能であったため、新たに高感度・低バックグラウンドのin situ Hybridyzation Chain Reaction法 (in situ HCR法)を導入して検出を試みる。
また、昨年度はT3up1-2A-Gal4カイコ系統を用いた性状解析により、バキュロウイルス感染時にT3up1発現が上昇する細胞は、脳および食道下神経節の一部領域に存在するグリア様細胞であることが明らかになった。この結果から、これらのグリア様細胞が包む神経領域でT3UP1タンパク質が受容されることで当該神経領域の活性が変化する可能性が考えられるため、次年度は空間トランスクリプトーム解析やシングルセルRNA-seq解析を行うことで、ウイルス感染が当該神経領域やT3up1発現グリア様細胞の遺伝子発現に及ぼす影響を網羅的に明らかにしたいと考えている。
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