研究課題/領域番号 |
21K15111
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研究種目 |
若手研究
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配分区分 | 基金 |
審査区分 |
小区分44020:発生生物学関連
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研究機関 | 基礎生物学研究所 |
研究代表者 |
池田 達郎 基礎生物学研究所, 生殖細胞研究部門, 特任助教 (60803963)
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研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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配分額 *注記 |
4,810千円 (直接経費: 3,700千円、間接経費: 1,110千円)
2023年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
2022年度: 1,820千円 (直接経費: 1,400千円、間接経費: 420千円)
2021年度: 1,820千円 (直接経費: 1,400千円、間接経費: 420千円)
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キーワード | マウス / 始原生殖細胞 / 原始卵胞 / 細胞系譜 / クローン / バーコード / 不均一性 / 卵母細胞 |
研究開始時の研究の概要 |
ほ乳類の卵は新生仔期に作られた原始卵胞のストックを段階的に発育して産生される。原始卵胞は胎仔に生じた始原生殖細胞(PGC)から作られる。個々のPGCに由来する原始卵胞の数と質は不均一であることが示唆されているが、詳細は不明である。 本研究では雌マウスの個々のPGCを多様なDNA配列で標識し、その運命を総体的に追跡することにより、PGCが作り出す原始卵胞の数と質の不均一性を定量的に評価し、より多数の原始卵胞ストックを作り出すPGCの特性を探索する。
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研究実績の概要 |
本研究では雌マウス胎仔の始原生殖細胞(PGCs)を非常に多様なDNAバーコードで標識して子孫細胞(クローン)を追跡することにより、個々のPGCのクローンが生じる原始卵胞の数と質の不均一性を解析する。 2021年度において卵巣に入った2000個程度のPGCsにバーコードを導入したのち、その後の原始卵胞が生じた生後10日までの複数の発生段階で卵巣を取得し、生殖細胞に含まれるバーコードをSequelシーケンスしていた。2022年度はまずそのシーケンス結果が届いたので解析した。卵巣に入ったPGCsは減数分裂を開始し、細胞死を伴いながら生後10日までに1/3まで細胞数が減少することが知られている。この過程で、バーコードの種類数は半分程度に減少すること、一方で200以上の多様性を維持していることが示唆された。これはPGCsが合胞体(シスト)を形成しシストあたり1つの卵母細胞を作り出すことを提唱した先行研究と矛盾しない結果であった。 2021年度の解析から、PGCsが遊走して卵巣に入る過程でクローンサイズの不均一性が生じることがわかっていた(この観察は雄と同様)。このとき、クローン間で遺伝子発現の違いがどのように存在するかを知るため、バーコード転写型マウスを用いて、誘導直後のPGCsをバーコード標識したのち、卵巣に入ったPGCsをFACSソートし、シングルセルでcDNAを増幅した。産物をもとにシングルセルRNA-seqおよびバーコードシーケンスのライブラリをそれぞれ作成し、シーケンス発送した。 本研究と並行して進めている雄生殖系列の研究が先に発展しており、2022年度は主に雄の成果を学会等で発表したが、付随して雌のデータを基に両性間の相違を議論した。
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現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究と並行しておこなっている雄の生殖系列の研究が大きく進行しているため、雌の研究の進行は緩やかであるが、それでも雌の生殖系列の特性を示唆するクローン多様性の時間変化データを得ることができた。 また、本研究計画の柱である雌生殖細胞のシングルセルでの遺伝子発現とバーコードの同時測定実験を、サンプル取得からライブラリ作成・発送まで、一連として達成することができた。
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今後の研究の推進方策 |
バーコード種類数の解析については個体数を増やす。また、リード数を基に有意なバーコードを抽出してより厳密に評価する必要があるため、共同研究者(ドイツのバーコード開発者・理論生物学者)と密接に議論して解析を進める。そこからクローンのサイズ分布に関しても評価を進める。 2022年度末のシングルセルRNA-seq・バーコードのシーケンスデータが届いたら、Cell Indexをもとにシングルセルごと遺伝子発現とバーコードの紐付け解析を行い、クローンごとの遺伝子発現特性を解析する。そこから、クローンサイズ(個々のクローンの細胞数)と相関する遺伝子発現特性を探索し、さらに発生段階との相関も検証する。 また、卵巣に入ったPGCsをバーコード標識し、原始卵胞が形成された新生仔の段階で同様のシングルセル遺伝子発現・バーコード測定解析をおこなう。クローンごとに形成された卵母細胞数と、活性化or休眠卵母細胞の比率を計算する。個々のPGCが作り出した休眠卵母細胞数の不均一性と、相関する遺伝子特性を探索する。
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