| 研究課題/領域番号 |
21K15133
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| 研究種目 |
若手研究
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| 配分区分 | 基金 |
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| 審査区分 |
小区分44040:形態および構造関連
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
菊地 真理子 名古屋大学, 理学研究科, 助教 (20845135)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円)
2024年度: 910千円 (直接経費: 700千円、間接経費: 210千円)
2023年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
2022年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2021年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
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| キーワード | 生殖細胞 / 性決定 / fbxo47 / 卵形成 / メダカ |
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| 研究開始時の研究の概要 |
生殖細胞が卵になるか精子になるかの運命決定は有性生殖を行う生物にとって極めて重要である。申請者のメダカを用いた研究から、ユビキチンリガーゼFBXO47が卵形成へのコミットメントに重要であり、その過程では卵形成経路と精子形成経路がせめぎ合っていることが示された。この性的拮抗関係においてFBXO47がメス性を確立していく仕組みを明らかするために、質量分析法を用いてFBXO47のユビキチン化基質を同定する。これと同時に、FBXO47のノックダウンおよび卵巣ライブイメージングの系を確立し、卵形成コミットメントに伴う細胞形態や染色体動態の変化を明らかにする。
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| 研究実績の概要 |
生殖細胞が卵あるいは精子に分化する過程では、卵形成経路と精子形成経路が拮抗的に働くことで分化運命を決定していると考えられる。本研究は、この性的拮抗関係において、ユビキチン化因子FBXO47がメス性を確立していく仕組みを明らかにし、生殖細胞の卵形成コミットメント（メス化）機構を解明することを目的としている。
これまでにfbxo47変異体メダカの生殖細胞では、生殖細胞の性的運命がメスからオスに転換すると同時に、染色体が異常な凝縮形態を示すことが明らかになっていた（Kikuchi et al., 2020, PNAS）。染色体の高次構造形成と生殖細胞の性分化との関連を明らかにするため、2023年度はメダカ生殖腺の初代培養系とライブイメージング系を統合して、生殖細胞の性分化過程における染色体動態の解明に取り組んだ。そのために、染色体の高次構造形成に関わるSYCP3をEGFPでラベルしたトランスジェニックメダカの卵巣および精巣の初代培養系を用いてライブイメージングを行い、減数分裂前期Iにおける核内EGFPシグナルをトラッキングした。さらにEGFPシグナルの動きを定量し、雌雄で比較した。その結果、相同染色体間に交叉が形成される特定のサブステージにおいて染色体が急速な回転運動を行うことが明らかになり、この運動速度には有意な雌雄差があることが示された。本成果は、卵巣と精巣の両方に未分化な生殖細胞を有するメダカで初めて明らかになったユニークな研究成果であると考えている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
前年度までに、初代培養系、ライブイメージング系、トランスジェニック系統の整備、イメージング定量解析系を確立した。2023年度は野生型の雌雄における染色体動態の詳細な解析データが得られ、ライブイメージング系によるfbxo47変異体の表現型解析に向けた準備は順調に進んでいると考える。現在、fbxo47変異体とsycp3-EGFPトランスジェニック系統を交配し、次世代での解析準備を行なっている段階である。
一方、FLAG抗体によるFBXO47の免疫沈降計画は想定外の事象により停滞している。2021年度に作出したfbxo47-3xFlagノックインメダカ系統は、予想に反してfbxo47変異体と同じ表現型を呈することが判明した。このため2023年度は異なる方法（Sce-I法）を用いてfbxo47-3xFlag導入メダカ系統を作出した。同時に、FBXO47抗体を作製し、免疫沈降を行うためのサンプル（卵黄を蓄積しない変異体メダカ）を準備している。
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| 今後の研究の推進方策 |
FBXO47の免疫沈降計画については、FBXO47抗体と変異体メダカ卵巣を用いた免疫沈降を進める。並行して、2023年度に作出したfbxo47-3xFlag導入系統の卵巣におけるFLAGの発現を確認し、免疫沈降への利用可能性を検討する。
ライブイメージングについては、2023年度に解析した野生型卵巣での核内染色体動態をベースとして、fbxo47変異体で同様のイメージング解析をおこない、野生型と比較して染色体動態におけるfbxo47の寄与を明らかにする。そのためにsycp3-egfpトランスジェニック系統とfbxo47変異体を交配してsycp3-egfp; fbxo47変異体を作出し、卵巣初代培養系を用いたライブイメージングおよび染色体動態解析を実施する。得られたデータを野生型メスと比較して変異体の表現型を定量的に示す。
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