自己増幅型RNAとナノ脂質粒子DDSを用いた軟骨無形性症治療法開発研究

• 研究課題/領域番号: 21K15350
• 研究種目: 若手研究
• 配分区分: 基金
• 審査区分: 小区分48030:薬理学関連
• 研究機関: 愛知医科大学 (2022); 岐阜薬科大学 (2021)
• 研究代表者: 家崎 高志 愛知医科大学, 医学部, 助教 (30784285)
• 研究期間 (年度): 2021-04-01 – 2024-03-31
• 研究課題ステータス: 交付 (2022年度)
• 配分額: 4,550千円 (直接経費: 3,500千円、間接経費: 1,050千円); 2023年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円); 2022年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円); 2021年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
• キーワード: 自己増幅型RNA / 遺伝子疾患 / 核酸医薬 / 軟骨無形性症 / 骨形成疾患 / 遺伝子治療 / Lipid nano particle

研究開始時の研究の概要

軟骨無形性症は内軟骨性骨化の異常により長管骨の成長障害をきたす難病のうちで最も頻度が高い疾患であり、FGFR3遺伝子の点変異が原因であると考えられている。申請者はこれまでに軟骨組織に対する新たな遺伝子治療法を探索し、自己増幅型RNAとナノ脂質粒子遺伝子導入法を用いたマウス軟骨組織への遺伝子導入法を世界に先駆けて成功した。そこで本研究課題では、①自己増幅型RNAを用いた骨組織への遺伝子発現制御法の確立を行い、②自己増幅型RNAを用いた軟骨無形性症の治療法開発研究を行う。その成果を、自己増幅型RNAを用いた治療薬開発のための研究基盤とする。

研究実績の概要

申請者はこれまでに軟骨組織に対する新たな遺伝子治療法を探索し、自己増幅型RNA(saRNA)とナノ脂質粒子遺伝子導入法を用いたマウス軟骨組織への遺伝子導入法を世界に先駆けて成功した。そこで本研究課題では、①自己増幅型RNAを用いた骨組織への遺伝子発現制御法の確立を行い、②自己増幅型RNAを用いた遺伝性骨疾患の治療法開発研究を行う。その成果を、自己増幅型RNAを用いた治療薬開発のための研究基盤とする。
本年度は申請者の所属研究機関を変更したこともあり、これまで使用していた研究試料の一部は使用が難しくなった。そのため、研究対象とする変異型遺伝子を従来のFGFR3遺伝子から、もう一つ予定していた進行性骨化性線維異形成症（FOP）の原因遺伝子であるACVR1変異遺伝子へと変更することとした。
本年度はまず、変異型ACVR1ノックダウン用RNAの設計とACVR1遺伝子変異筋芽細胞への効果を検討した。FOP患者の原因遺伝子であるACVR1R206H点変異のみを抑制するsaRNAを設計ソフトにより作製した。
設計したsaRNAをACVR1R206H変異を導入したC2C12筋芽細胞に導入し、導入細胞のタンパク質を回収し、変異型ACVR1のみがノックダウンされるか検討した。変異型ACVR1ノックダウン用saRNAをACVR1R206H変異型C2C12細胞に導入した結果、変異型ACVR1のみが有意に発現低下し、野生型ACVR1の発現は有意な変化は認められなかった。また、変異型ACVR1ノックダウン用saRNAを導入したACVR1R206H変異型C2C12細胞を軟骨細胞へ分化させた結果、変異型ACVR1ノックダウン用saRNAを導入した細胞では軟骨細胞への分化が抑制されたいた。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

申請者自身の自己都合により、昨年度から別の研究機関へ移動することになった。その際に、使用を予定していた遺伝子改変マウスなどが使用できない状態が続いていたため、研究対象とする遺伝子をFGFR3から、別に予定していたACVR1へと変更した。そのため変異型ACVR1遺伝子を抑制するsaRNAを新たに設計することから始めたため、当初の予定から遅れている状況である。
研究の要となる変異型ACVR1遺伝子を抑制するsaRNAを設計し、それを利用して変異型ACVR1遺伝子の発現を抑制し、C2C12細胞の軟骨細胞への分化を抑制することができたが、研究状況の遅れを鑑みて、本研究課題の進行状況を(3)と判断した。

今後の研究の推進方策

ACVR1 R206H変異導入C2C12細胞にsaRNAを導入することで、変異遺伝子の発現を抑制し、軟骨細胞への分化を抑制することができたため、今後はFOP患者由来ヒトiPS細胞をRIKEN BRCから入手し、iPS細胞にノックダウン用saRNAが導入可能か検討する。また、導入したiPS細胞の軟骨細胞への分化がマウスの細胞と同様に回復するか検討する。
また、ACVR1 R206H TgマウスにsaRNAを導入し、骨の異常形成の表現型が回復するか検討する予定である。

研究成果

• [雑誌論文] L-type amino acid transporter 1 in hypothalamic neurons in mice maintains energy and bone homeostasis. (2023)
  • 著者名/発表者名: Park G, Fukasawa K, Horie T, Masuo Y, Inaba Y, Tatsuno T, Yamada T, Tokumura K, Iwahashi S, Iezaki T, Kaneda K, Kato Y, Ishigaki Y, Mieda M, Tanaka T, Ogawa K, Ochi H, Sato S, Shi YB, Inoue H, Lee H, Hinoi E.
  • 雑誌名: JCI Insight 巻: 8 号: 7
  • DOI: 10.1172/jci.insight.154925
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] The L-type Amino Acid Transporter (LAT1) Expression in Patients with Scoliosis (2022)
  • 著者名/発表者名: Demura Satoru、Hinoi Eiichi、Kawakami Noriaki、Handa Makoto、Yokogawa Noriaki、Hiraiwa Manami、Kato Satoshi、Shinmura Kazuya、Shimizu Takaki、Oku Norihiro、Annen Ryohei、Kobayashi Motoya、Yamada Yohei、Nagatani Satoshi、Iezaki Takashi、Taniguchi Yuki、Tsuchiya Hiroyuki
  • 雑誌名: Spine Surgery and Related Research 巻: 6 号: 4 ページ: 402-407
  • DOI: 10.22603/ssrr.2021-0189
  • NAID: 130008136374
  • ISSN: 2432-261X
  • 年月日: 2022-07-27
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] The role of CDK8 in mesenchymal stem cells in controlling osteoclastogenesis and bone homeostasis (2022)
  • 著者名/発表者名: Yamada Takanori、Fukasawa Kazuya、Horie Tetsuhiro、Kadota Takuya、Lyu Jiajun、Tokumura Kazuya、Ochiai Shinsuke、Iwahashi Sayuki、Suzuki Akane、Park Gyujin、Ueda Rie、Yamamoto Megumi、Kitao Tatsuya、Shirahase Hiroaki、Ochi Hiroki、Sato Shingo、Iezaki Takashi、Hinoi Eiichi
  • 雑誌名: Stem Cell Reports 巻: 17 号: 7 ページ: 1576-1588
  • DOI: 10.1016/j.stemcr.2022.06.001
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Conditional inactivation of the L‐type amino acid transporter LAT1 in chondrocytes models idiopathic scoliosis in mice (2022)
  • 著者名/発表者名: Iwahashi Sayuki、Lyu Jiajun、Tokumura Kazuya、Osumi Ryoma、Hiraiwa Manami、Kubo Takuya、Horie Tetsuhiro、Demura Satoru、Kawakami Noriaki、Saito Taku、Park Gyujin、Fukasawa Kazuya、Iezaki Takashi、Suzuki Akane、Tomizawa Akane、Ochi Hiroki、Hojo Hironori、Ohba Shinsuke、Hinoi Eiichi
  • 雑誌名: Journal of Cellular Physiology 巻: 237 号: 11 ページ: 4292-4302
  • DOI: 10.1002/jcp.30883
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] SMURF2 phosphorylation at Thr249 modifies glioma stemness and tumorigenicity by regulating TGF-β receptor stability (2022)
  • 著者名/発表者名: Hiraiwa Manami、Fukasawa Kazuya、Iezaki Takashi、Sabit Hemragul、Horie Tetsuhiro、Tokumura Kazuya、Iwahashi Sayuki、Murata Misato、Kobayashi Masaki、Suzuki Akane、Park Gyujin、Kaneda Katsuyuki、Todo Tomoki、Hirao Atsushi、Nakada Mitsutoshi、Hinoi Eiichi
  • 雑誌名: Communications Biology 巻: 5 号: 1 ページ: 22-22
  • DOI: 10.1038/s42003-021-02950-0
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Erk5 in Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Regulates Bone Homeostasis by Preventing Osteogenesis in Adulthood (2022)
  • 著者名/発表者名: Horie Tetsuhiro、Fukasawa Kazuya、Yamada Takanori、Mizuno Seiya、Iezaki Takashi、Tokumura Kazuya、Iwahashi Sayuki、Sakai Shiho、Suzuki Akane、Kubo Takuya、Osumi Ryoma、Tomizawa Akane、Ochi Hiroki、Sato Shingo、Kaneda Katsuyuki、Takahashi Satoru、Hinoi Eiichi
  • 雑誌名: Stem Cells 巻: - 号: 4 ページ: 011-011
  • DOI: 10.1093/stmcls/sxac011
  • 査読あり
• [雑誌論文] CDK8 maintains stemness and tumorigenicity of glioma stem cells by regulating the c-MYC pathway (2021)
  • 著者名/発表者名: Fukasawa K, Kadota T, Horie T, Tokumura K, Terada R, Kitaguchi Y, Park G, Ochiai S, Iwahashi S, Okayama Y, Hiraiwa M, Yamada T, Iezaki T, Kaneda K, Yamamoto M, Kitao T, Shirahase H, Hazawa M, Wong RW, Todo T, Hirao A, Hinoi E.
  • 雑誌名: Oncogene 巻: ー 号: 15 ページ: 2803-2815
  • DOI: 10.1038/s41388-021-01745-1
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] MAPK Erk5によるユビキチンリガーゼSmurf2^Thr249のリン酸化を介したTGF-βシグナル調節機構 (2021)
  • 著者名/発表者名: Iezaki Takashi、Hinoi Eiichi
  • 雑誌名: 日本薬理学雑誌 巻: 156 号: 5 ページ: 271-274
  • DOI: 10.1254/fpj.21029
  • NAID: 130008081904
  • ISSN: 0015-5691, 1347-8397
  • 査読あり
• [学会発表] 自己増幅型RNAを用いた新規遺伝子治療法の開発研究 (2022)
  • 著者名/発表者名: 家﨑 高志、佐藤 元彦
  • 学会等名: 第69回中部日本生理学会
• [備考] 愛知医科大学 医学部 生理学講座
  • URL: http://www.aichi-med-u.ac.jp/physio2/
• [備考] 愛知医科大学 生理学講座
  • URL: https://www.aichi-med-u.ac.jp/su06/su0607/su060702/02.html
• [備考] 岐阜薬科大学 機能分子学大講座 薬理学研究室
  • URL: https://sites.google.com/gifu-pu.ac.jp/labo-yakuri
• [備考] 研究成果】生後の骨形成を制御する"キープレイヤー"を発見！ -骨系統疾患に対する新規治療法の開発へ-
  • URL: https://www.gifu-pu.ac.jp/news/2022/03/research-20220323-01.html
• [備考] 薬理学研究室の檜井栄一教授ら、がん幹細胞の機能を制御する"スイッチ"を発見！
  • URL: https://www.gifu-pu.ac.jp/news/2022/01/post-69.html