| 研究課題/領域番号 |
21K15375
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| 研究種目 |
若手研究
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| 配分区分 | 基金 |
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| 審査区分 |
小区分49010:病態医化学関連
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| 研究機関 | 奈良県立医科大学 |
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研究代表者 |
牧野 舞 奈良県立医科大学, 医学部, 助教 (10736870)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,550千円 (直接経費: 3,500千円、間接経費: 1,050千円)
2023年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2022年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
2021年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
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| キーワード | リアノジン受容体 / 選択的スプライシング / カルシウムシグナル / 心筋 / 膵β細胞 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
主に心筋細胞で発現する2型リアノジン受容体（RyR2）にはexon 75領域の有無という組織特異的スプライシングバリアントが存在する。Exon 75欠失型（膵β細胞型）RyR2を発現する膵β細胞においてゲノム編集技術によりexon 75含有型（心筋型）RyR2を発現させるとインスリン生合成機構が著しく低下することをこれまでに見出した。本研究では，同様の手法を用いてexon 75欠失型（膵β細胞型）RyR2を発現する心筋細胞及びマウスを作製し，RyR2の発現型の変化が心筋機能にどのような影響を及ぼすか検証し，RyR2の組織特異的選択的スプライシングバリアントの存在意義を明らかにする。
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| 研究実績の概要 |
リアノジン受容体（RyR）は小胞体内腔から細胞質へのCa2+の放出を担うCa2+チャネルであり，主に心筋細胞で発現する2型RyR（RyR2）にはexon 75領域を含む「心筋型」とexon 75領域を欠く「膵β細胞型」という組織特異的選択的スプライシングバリアントが存在する。これはRyR2遺伝子のintron 75のスプライシング開始配列（スプライスドナー配列）が通常の「gt」ではなく「gg」であることに起因すると考えられた。これまでの研究（2019～2020年度若手研究）で，膵β細胞型RyR2を発現する膵β細胞においてCRISPR/Cas9ゲノム編集技術によりスプライスドナー配列を「gt」へ変異させ心筋型RyR2を発現させるとインスリン生合成機能の顕著な低下がみられることを見出した。本研究では，RyR2のスプライス型（発現型）の変化が心機能へどのような影響を及ぼすのかを調べ，RyR2の組織特異的スプライシングバリアントの存在意義の解明を目指す。
CRISPR/Cas9を用いRyR2 intron 75のスプライスドナー配列を「gt」に変異させたホモ改変マウスでは，野生型マウスと比較し生育状態や心臓の組織像に顕著な差はみられなかった。そこで，スプライス型の変化の影響をより広く検証するためにRyR2を介するCa2+シグナルが関与するインスリン分泌能について調べた。野生型マウス及びホモ改変マウスより単離した膵島に対しグルコース刺激実験を行ったところ，野生型と比較しホモ改変マウス由来膵島では高グルコース添加による分泌インスリン量の増加はみられなかったことから，グルコース応答性が低下している可能性が示唆された。今後は，運動負荷試験などによる心機能評価やグルコース負荷試験などによるインスリン分泌能評価などを行い，スプライス型の変化が及ぼす影響についてin vivoでの検証を進める。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
In vivoでの機能評価実験に供する野生型及びホモ改変型の雄マウスの必要数獲得のための繁殖に時間を要し，当該年度中にin vivoの実験を進めることができず，全体の実験の行程に遅延が生じている。
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| 今後の研究の推進方策 |
野生型マウスとゲノム改変マウスとでは生育状態や心臓の組織像に顕著な差は認められなかったため，スプライス型の変化の影響をより広く検証するためにRyR2を介したCa2+シグナルにより惹起される機能のうちインスリン分泌能について検証を進めている。今後は運動負荷試験などによる心機能評価やグルコース負荷試験などによるインスリン分泌能評価などin vivoでの機能解析実験を実施し，得られた研究成果を学術論文にまとめ発表する予定である。
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