| 研究課題/領域番号 |
21K15913
|
|---|
| 研究種目 |
若手研究
|
| 配分区分 | 基金 |
|---|
| 審査区分 |
小区分52050:胎児医学および小児成育学関連
|
|---|
| 研究機関 | 国立研究開発法人国立成育医療研究センター |
|---|
研究代表者 |
三浦 茜 国立研究開発法人国立成育医療研究センター, 成育遺伝研究部, (非)研究員 (40795449)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2027-03-31
|
| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
|
| 配分額 *注記 |
4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円)
2025年度: 130千円 (直接経費: 100千円、間接経費: 30千円)
2024年度: 650千円 (直接経費: 500千円、間接経費: 150千円)
2023年度: 1,040千円 (直接経費: 800千円、間接経費: 240千円)
2022年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
2021年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
|
|---|
| キーワード | 遺伝子治療 / アンジェルマン症候群 / UBE3A-ATS転写抑制 / CRISPR/dCas9 / AAV5 / 神経疾患 / 先天性疾患 / AAV |
|---|
| 研究開始時の研究の概要 |
アンジェルマン症候群（Angelman syndrome: AS）は、重度の精神遅滞、てんかん、失調性運動障害を引き起こす遺伝性の神経発達障害疾患であり、未だ根本治療はない。神経細胞において母片由来のUbe3a遺伝子の欠失や変異によりUbe3a遺伝子が働かなくなると、ASを引き起こすと考えられている。一方、父方由来Ube3a遺伝子は無傷で沈黙している状態のため、正常なUbe3a発現の源となる可能性がある。そこで本研究では、不活性型Cas9と転写抑制因子(KRAB)を用いた特定の遺伝子の発現を調節する技術により、神経細胞で高効率に父方由来Ube3a遺伝子を働かせる新規遺伝子治療の開発を試みる。
|
| 研究実績の概要 |
アンジェルマン症候群はUbe3a遺伝子の欠失や変異による機能障害から引き起こされる。本研究では、dCas9-KREB-MeCPsによるUBE3A-ATS領域の転写調節技術によって、SNRPN領域のプロモーターで始まる伸長反応を抑制することで、Ube3a遺伝子発現回復を試みる。
本年は、2022年6月1日から2023年4月10日まで、産前産後休暇と育児休業を取得していたため、休業期間は研究を中断していた。育児休業が終わり、研究が再開してから、細胞培養と遺伝子導入の実験準備を進めている。
今後は、SH-SY5Y株にdCas9-KRAB-MeCP2ベクターとgRNA発現ベクターをエレクトロポレーション法により遺伝子導入を行い、UBE3A-ATS発現低下レベルにより、遺伝子治療に最適なgRNAを選択する。さらに、dCas9-KRAB-MeCP2ベクターと最適なgRNAベクターの配列を搭載した、AAV5ウイルスベクターの作製を行う予定である。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
産前産後休暇と育児休業を取得したため、本年度の目標であった、最適なgRNA選択のために、神経芽細胞腫へのCas9ベクターと複数のgRNAベクターの遺伝子導入による、UBE3A-ATS発現低下の解析ができていない。遺伝子治療に最適なgRNAを選択した後、AAV5ウイルスベクターの作製を行う予定である。
|
| 今後の研究の推進方策 |
神経芽細胞腫を用いて、UBE3A-ATS転写抑制に最適なgRNA配列を確認した後、Cas9配列と選択したgRNA配列を含むウイルスベクターを作製する。作製したウイルスベクターをHEK293T細胞へ遺伝子導入を行い、ウイルス産生細胞を作製する。ウイルス産生細胞から、AAV Extraction solutionを使用して、ウイルス粒子の精製を行う。作製したウイルス粒子は神経芽細胞腫に感染させ、UBE3A-ATS発現低下の確認を行う。
|
