| 研究課題/領域番号 |
21K16121
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| 研究種目 |
若手研究
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| 配分区分 | 基金 |
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| 審査区分 |
小区分53030:呼吸器内科学関連
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| 研究機関 | 自治医科大学 |
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研究代表者 |
藤田 一喬 自治医科大学, 医学部, 講師 (20887848)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2021年度)
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| 配分額 *注記 |
4,550千円 (直接経費: 3,500千円、間接経費: 1,050千円)
2023年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
2022年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2021年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
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| キーワード | 迅速高感度PCR法 / NGS法 / 血漿cfDNA / 肺癌 / PNA-LNA dual PCR（PLDP） / 迅速高感度Real-time PCR法 / 細胞検体 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
申請者は，微量な遺伝子変異を含む検体からの迅速高感度検出法PNA-LNA dual PCR（PLDP）法を開発した。鋳型DNAに対しPLDP法とNGS法を行った結果を比較し，また，PLDP増幅産物をNGS法で解析することで，両者の正確な検出率を明らかとし，安価なPLDPと高価なNGSの検出力に遜色がないことを証明する。これにより，比較的安価に，低侵襲な検体を用いての迅速高感度の検査が可能となる。また，網羅的に血漿cell-free DNA（cfDNA）に対し，同様の解析を行うことで，肺癌の病期ごとの検出率を明らかにし，肺癌遺伝子変異の検査検体としての血漿cfDNAの位置づけを明確化する。
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| 研究実績の概要 |
我々が開発した迅速高感度のReal-time PCR法（PNA-LNA dual PCR：PLDP法）と、NGS法を比較した。NGS法は、version-upしたため、旧法と新法と比較した（NGS-A法→NGS-C法）。2016年12月～2019年3月までの、主に気管支鏡で回収した細胞検体を用い、drive遺伝子変異と獲得耐性T790Mの両者の検出のあった17検体で比較した。EGFR遺伝子変異［Ex19del/L858R/T790M］の検出数は、細胞検体を用いた群では、PLDP法［10/7/17］、NGS-C法［10/7/9］、NGS-A法［8/5/8］に対し、組織検体を用いたコンパニオン診断では[8/6/5]であり、PLDP法の検出率は優れていた。
次に、抽出したDNA自体と、PLDP法の1st amplicon（PNAにより変異のない遺伝子の増幅が抑制され、変異のある遺伝子変異のみ増幅されたPCR産物）を精製したものを、NGS-C法で解析した結果、Ex19delの領域は1/10（15.6x10^3±9.6x10^3 reads→1.4x10^3±0.88x10^3 reads）に、L858Rの領域は1/1000（2.2x10^3±16.2x10^3 reads→ 3.1±2.3 reads）に、T790Mの領域は1/10000（21.82x10^3±14.3x10^3 reads → 2.0±1.3 reads）に、変異のない遺伝子の増幅は抑制されていた。変異のある遺伝子はほぼ同数の断片数であり、PNAによる変異のない遺伝子の増幅抑制が確認された。
また、上記期間内で提出された血液検体の血漿より抽出されたcell-free DNA（cfDNA）と、同時に採取された細胞検体からのDNAを、PLDP法で検出した結果、肺癌の進行が進むにつれて検出率が上昇することが確認された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
迅速高感度のReal-time PCR法（PNA-LNA dual PCR：PLDP法）については、2016年12月～2019年3月までに気管支鏡から採取された細胞検体や胸水、リンパ節針生検等の細胞検体、および、同時採取された血液検体からの血漿cfDNAの解析を行い、その結果を論文投稿した（Cancer Med. 2021 Dec;10（23）:8595-8603. doi:10.1002/cam4.4330）。
2019年4月以降も検体採取は継続しており、現在までに、血液検体と同時で、約180検体が追加で提出されている。PLDP法、および、NGS-C法の解析は終了している。
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| 今後の研究の推進方策 |
上記、追加の180検体について、有意な検体や、PLDP法とNGS-C法で結果に差があるもの、PLDP法と組織検体を用いたコンパニオン診断で結果に差があるものについて、PLDP法の1st PCR ampliconの精製を行い、それを鋳型としてNGS-C法での追加解析を行う。
また、追加の180検体についても患者背景の情報を収集し、血漿cfDNAからの検出率のdataを確定する。また、『臨床検体からの良質DNA、RNA抽出法』を新たに開発した。新たな抽出法のDNA partの遺伝子変異含有の確認には、先駆けとしてPLDP法を用いた。今後、特許申請を予定している。
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