| 研究課題/領域番号 |
21K16124
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| 研究種目 |
若手研究
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| 配分区分 | 基金 |
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| 審査区分 |
小区分53030:呼吸器内科学関連
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| 研究機関 | 日本医科大学 |
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研究代表者 |
梶本 雄介 日本医科大学, 医学部, 助教 (10899082)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円)
2023年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
2022年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
2021年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
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| キーワード | 低真空走査電子顕微鏡 / 通常型間質性肺炎 / 非特異性間質性肺炎 / 特発性器質化肺炎 / 腔内線維化 / 酢酸ウラン染色 / PPFE |
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| 研究開始時の研究の概要 |
炎症性びまん性肺病変の炎症細胞浸潤から連続する線維化、嚢胞化をきたし改築される肺病変の、特に早期過程のLV-SEMを主体とした詳細な微細肺胞構造の解析を行い付随するリモデリングについての予後予測に繋がる病態の解明を微細肺胞構造変化の把握を通じて試みる。炎症性、線維性の肺病変の標本に対し、低真空走査型電子顕微鏡のTIブルーやPAM染色像を用いて早期の超微形態学的な変化を、免疫染色を含めた光学顕微鏡の組織像を照らし合わせる事でより詳細に把握する。これらの評価をまずはモデルマウスで行った後に、ヒトの病理検体でも行う。
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| 研究実績の概要 |
LV-SEMを用いた肺構造の評価基準は確立されておらず、ヒトノーマル肺組織や器質化肺炎などの早期病変を主な対象とした。
ヒトノーマル肺組織を対象として過ヨウ素酸メセナミン銀（PAM）染色標本および白金ブルー（Pt-blue）染色を作製した。PAM染色では肺胞壁における肺胞上皮－血管の間を介在する基底膜や繊細な間質の微細構造は、当施設の腎正常組織の糸球体係蹄における上皮－血管の間の基底膜や間質所見と類似性が見られた。Pt-blue染色では、肺胞上皮、血管内皮、平滑筋などを超微形態学的にある程度識別可能であった。
近年の腎炎や角膜傷害に関するLV-SEMの論文では、糸球体基底膜の網目構造や二重化、角膜の血管新生などが報告されてきた (Biomed Res. 2020;41(2)) (Case Rep Nephrol Dial. 2021 Jan-Apr; 11(1)) (Transl Vis Sci Technol. 2020; 9(6))。間質性肺炎などでも、肺胞上皮-間質-毛細血管は腎炎の糸球体係蹄のような変化を来す可能性があり、超微形態学的な評価においてLV-SEMの解析が有効な可能性がある。
正常や早期病変などの構造把握に関する評価基準の確立が先決と考える。しかし、抗体沈着や抗原抗体反応を来す疾患が多い腎や血管新生などを識別しやすい角膜と異なり、肺は容積が大きい気腔構造がある為、解析がより複雑で、染色対象がそれぞれ間質、細胞に限ったPAM染色やPt-blue染色での評価は困難と考えられた。そこで細胞と間質ともに染色され立体構造を把握しやすいように、厚さ10μmの切片で酢酸ウラン染色を追加し検討した。早期の器質化肺炎で、腔内線維化は周囲の肺胞壁と判別可能で、被覆上皮もある程度識別された。今後、免疫染色を併用し筋線維芽細胞の分布などもより立体的、超微形態学的に検討する予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
2023年4月現在、低真空走査電子顕微鏡（LV-SEM）の対象に選定している検体は主に過ヨウ素酸メセナミン銀（PAM）染色および白金ブルー（Pt-blue）染色にて評価を行った。しかし腎臓と違いair spaceの目立つ肺標本において、間質を主な対象とするPAM染色や細胞を主な対象とするPt-blue染色のみでは十分な評価が難しいと考えられた。特にLV-SEMのPt-blue染色において、病態に伴い剥離した上皮の性状の明瞭な識別は比較的困難であった。その結果、改めて選定した全症例には細胞と間質ともに対象となる酢酸ウラン染色を追加し、立体構造の包括的な評価の必要性が考えられた。
LV-SEMにおける肺の正常基準が確立されていない事を考慮し、疾患群の検体は比較的早期の病変で正常領域の残存確認が容易なものが疾患群の検体として望ましいと思われた。その一つとして選定された早期の器質化肺炎は病変と周囲の肺組織との境界が把握しやすく、正常な肺組織検体と併用して評価基準の確立に有用と考えられた。しかし現時点では器質化肺炎以外で有用な肺疾患の選定が、完了していない。例として早期のうっ血、幼弱な線維化が目立つ通常型間質性肺炎、早期の肺胞腔内を主座とする肉芽腫性炎症などがあげられるが、標本の選定が想定されたより時間を要している。
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| 今後の研究の推進方策 |
低真空走査電子顕微鏡（LV-SEM）における評価基準が確立しておらず、正常、疾患群ともに主にヒト由来の肺組織から標本を作成、評価する。その後は進行した肺疾患の評価も施行予定だが、こちらはまず過去の研究で用いられたモデルマウスを用いる（J Cell Mol Med. 2019 Oct;23(10)）。
これまでの研究では、ホルマリン固定下で従来の電顕と同様に観察可能とする報告がある一方で、グルタール固定下の検体がより糸球体の微細な変化を確認し易いとする報告もあり、明確に結論は出ていない（Pathol Res Pract. 2012 Sep 15;208(9)）（Clin Exp Nephrol. 2022 Mar;26(3)）。そのため全ての検体でパラフィン固定後に、改めてグルタール固定下の標本も作成し、どちらが有用な肺の所見を得られるか比較する。評価の参照所見として通常の走査電子顕微鏡（SEM）を用いた肺疾患の論文も用いる (Arch Histol Cytol. 2004;67(1)) (Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2021;25(24)）。
その他に間質性肺炎における剥離、変性した肺胞上皮や線維化巣の筋線維芽細胞の分布などのより詳細な評価の補助として、keratin、α-SMAなどの免疫染色のLV-SEM標本も作製する。LV-SEMにおいて、過去の動物実験やヒトの症例検討では免疫染色を併用したものを含め腎疾患における糸球体の上皮細胞の突起消失および角膜創傷治癒の血管新生などの微細な所見が報告されている（Clin Exp Nephrol. 2022 Mar;26(3)）(Transl Vis Sci Technol. 2020 May 16;9(6):14)。肺胞壁の上皮、血管内皮、線維化巣の間質細胞などの微細な早期変化を認める可能性が期待される。
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