脳動脈瘤感受性遺伝子ANGPTL6のレア・バリアント関連解析

• 研究課題/領域番号: 21K16617
• 研究種目: 若手研究
• 配分区分: 基金
• 審査区分: 小区分56010:脳神経外科学関連
• 研究機関: 東京女子医科大学
• 研究代表者: 大渕 英徳 東京女子医科大学, 医学部, 講師 (30532692)
• 研究期間 (年度): 2021-04-01 – 2025-03-31
• 研究課題ステータス: 交付 (2023年度)
• 配分額: 4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円); 2022年度: 1,820千円 (直接経費: 1,400千円、間接経費: 420千円); 2021年度: 2,470千円 (直接経費: 1,900千円、間接経費: 570千円)
• キーワード: 脳動脈瘤 / くも膜下出血 / 感受性遺伝子 / レアバリアント / ANGPTL6遺伝子 / ANGPTL6 / レア・バリアント / 関連解析

研究開始時の研究の概要

脳動脈瘤は重篤なクモ膜下出血の主たる原因であり、その発生に遺伝的要因が関与する多因子疾患である。ゲノムワイド関連解析により、コモン・バリアントが関連する感受性遺伝子として種々の遺伝子座が特定されてきた。近年では次世代シーケンシング技術を利用して、一般人口での頻度が稀で効果サイズの高いレア・バリアントを探索する研究も行われており、ヨーロッパ人患者を対象とした研究で、血管新生因子アンジオポエチン様増殖因子のひとつをコードするANGPTL6遺伝子の機能的レア・バリアントが脳動脈瘤の発生に関連することが報告された。本研究では、日本人脳動脈瘤患者におけるANGPTL6遺伝子の関与を詳細に検証する。

研究実績の概要

脳動脈瘤の候補遺伝子ANGPTL6について、多数の患者・対照サンプルでシーケンシング解析を行い、機能的レアバリアントと脳動脈瘤発生との関連を検証している。患者群では600例を超えるサンプルでのシーケンシングを行い、新たに収集されたサンプルについても随時シーケンシングを追加してきた。一般人口でのアリル頻度が１％未満で、種々の遺伝子変異機能予測プログラムにより機能障害性と判定されるレアバリアントが、特にクモ膜下出血症例を中心に複数例で検出されている。シーケンシングと並行して、検出されたレアバリアントについては、培養細胞を用いた機能解析が行えるよう体制を整備した。ミスセンスバリアントについては、HiBiTタグを付加したANGPTL6発現ベクターに変異導入し、培養細胞株に強制発現させることにより蛋白発現解析が可能である。これにより蛋白発現が著名に減少するミスセンスバリアントの特定に成功した。細胞局在変化も検証できるよう、蛍光蛋白タグを付与したベクターによる観察も実施できるようになっている。また、5’非翻訳領域からもレアバリアントが検出されており、ルシフェラーゼアッセイによる機能解析法も整備した。深海エビのルシフェラーゼ開始コドン直前部分にANGPTL6の5’非翻訳領域を連結して変異導入することにより、発現または翻訳効率への影響が定量可能となった。対照サンプルのシーケンシングデータについては、これまでに蓄積してきた対照サンプルの他、 公共データベースで公開されている個体のデータや、本学で実施された多数の次世代シーケンシングデータをインハウス対照として活用し、合計して500例を超える対照群となっている。レアバリアント関連解析により脳動脈瘤発生との関連を統計学的に検証する。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

実験実施場所である本学の総合医科学研究所の建て替えと移転があり、実験機器使用に制限がかかった時期があったため。

今後の研究の推進方策

シーケンシング解析により読みが不良であったエクソン領域の再解析など、シーケンシングデータの補完を完了する。新たに検出される機能的候補バリアントがあれば、HiBiTや蛍光蛋白タグを付与した発現ベクター、あるいはルシフェラーゼベクターに変異導入して機能解析を実施する。最終年度として結果の取りまとめを行い、学会発表や論文報告を行う。