| 研究課題/領域番号 |
21K16652
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| 研究種目 |
若手研究
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| 配分区分 | 基金 |
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| 審査区分 |
小区分56020:整形外科学関連
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
石塚 真哉 名古屋大学, 医学部附属病院, 講師 (40813316)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円)
2023年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2022年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
2021年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
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| キーワード | ヒアルロン酸 / 変形性膝関節症 / マウス / DMM / HAS2 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
ヒアルロン酸の関節注射は膝OAに対して多くの基礎・臨床研究により除痛・抗炎症効果が示されており、膝OAに対する保存治療として現在広く行われている。一方で、膝への頻回の注射による痛み、感染症の可能性、また最も重要な点として投与された、中・高分子ヒアルロン酸は、そのほとんどが軟骨細胞へ到達できていないなどの問題点が存在する。本研究は、軟骨深層まで到達可能であるウイルスベクターを用いてヒアルロン酸合成酵素であるHAS2を軟骨細胞、滑膜細胞に遺伝子導入し、内因性ヒアルロン酸の発現を亢進させ、OA膝に対する効果を検証する
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| 研究実績の概要 |
申請時に記載したIn vitroの先行研究に続くin vivo実験として、研究計画にあったDMM OAモデルマウスの作成を行い、OA変化が生じていることの確認を行うため、DMM OAモデルマウスを作成後、マウス膝関節を採取し、組織標本を悪性後、HE染色、サフラニンO（S-O）染色などをおこなった。OAモデルマウスにおいてはS-O染色において濃染するプロテオグリカンに富んだ組織が大きく減少しており、プロテオグリカンの喪失が生じていることを確認した。DMM OAモデルマウスの作成に関しては確認ができたと考えている。
また同組織における免疫組織化学染色を行いMMP-3、-13の発現解析により各種分解酵素のタンパクの発現上昇、局在を確認した。上記の作成したDMM OAモデルマウスを用いて、現在本研究と平行してその効果に関する研究を行っているヒアルロン酸合成阻害剤である4-Methylumbelliferone, 4-MUをマウス膝関節内に投与し、上述した各種OA変化が抑制されることを確認した。それらの成果は「Journal of orthopaedic research, 2020」で報告されている。同様にDMM OAモデルマウスを作成し、膝関節内にドキシサイクリン誘導型のHAS2過剰発現アデノウイルスベクターを膝関節に投与、ベクターによる遺伝子導入がされるか、又、ドキシサイクリンの内服によって過剰発現が生じるかについてin vivoの実験を行っていたが、マウスの餌にドキシサイクリンを含有させる手法による関節内組織でのHAS2過剰発現を様々な方法で確認したが、最終的に確認するに至らなかった。ドキシサイクリン誘導型のHAS2過剰発現アデノウイルスベクターの使用は断念し、現在Adeno-HAS2-ZsGreenというドキシサイクリンを用いない恒常発現型のベクターを用いた実験を進めている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
in vivoの実験において、ドキシサイクリンの内服による関節内組織でのHAS2の過剰発現が生じるかの確認に時間を要したが確認できるに至らず断念し、ドキシサイクリンを用いない恒常発現型のベクターを用いる実験をすすめている。
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| 今後の研究の推進方策 |
DMM OA model mouseの作成が可能になったため、得られた結果をもとにAd-HAS2-ZsGreenを膝関節内に投与、その後に2, 4, 8, 12週で膝関節の組織切片を作成、膝関節内でのヒアルロン酸の産生をHyaluronan binding protein (HABP) 染色にて評価、ヒアルロン酸の分子量をHA-ELISAで評価、またHE染色、サフラニンO染色でOAの進行度を評価する。また免疫組織化学染色でMMP13、ADAMTS-4の発現の評価を行いHAS2 の過剰発現による抗炎症作用に関する評価を行う。
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