| 研究課題/領域番号 |
21K16834
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| 研究種目 |
若手研究
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| 配分区分 | 基金 |
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| 審査区分 |
小区分56050:耳鼻咽喉科学関連
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| 研究機関 | 名古屋市立大学 |
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研究代表者 |
勝見 さち代 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 臨床研究医 (60625565)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,550千円 (直接経費: 3,500千円、間接経費: 1,050千円)
2023年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2022年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
2021年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
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| キーワード | Cochlear Synaptopathy / 騒音性難聴マウスモデル / Bisphosphonate / 感音難聴 / Zoledronate / Hidden hearing loss |
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| 研究開始時の研究の概要 |
騒音性難聴マウスモデル(in vivo)を用いて暴露後にZoledronateを投与し、cochlea
synaptopathyの治療効果を生理学的・組織学的に検討し、さらに、薬物作用機序を分子生物学的に解析する。騒音前・後、治療後に聴覚検査により難聴を生理学的に評価する。2週間後蝸牛を採取し、内有毛細胞と求心性蝸牛神経とのシナプス変性を組織学的に評価する。ZoledronateのターゲットであるFPPSの内耳における発現を組織学的に検討し、FPPS作用点より下流の生成物（FPP、GGPP、GTPase等）の騒音、治療介入による変動を分子生物学的に検討する。
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| 研究実績の概要 |
本研究は、騒音性難聴マウスモデル(in vivo)を用いて、第二世代Bisphosphonate であるZoledronateの難聴改善効果につき、生理学的ならびに組織学的に検討 し、さらに、薬物作用機序について分子生物学的に解析し、Zoledronateのドラッグ・リポジショニングの可能性を探ることである。
騒音性難聴マウスモデルを用いて、騒音暴露後にZoledronateもしくは同量のsalineを皮下投与し、聴力の生理学的評価として、暴露前・後、治 療2週間後に、歪成分耳音響放射検査 (DPOAE: Distortion Product Oto Acoustic Emissions)、聴性脳幹反応 (Auditory Brain stem Response: ABR) 第I波を測定し、暴露前・後、治療後の聴覚閾値を定性的に、I波の振幅を定量的に評価した。結果、聴覚閾値に明らかな変化は認めなかったが、治療群においてI波の振幅が有意に改善し難聴への治療効果が示唆された。また、cochlear wholemountを作成し免疫染色にて組織学的に解析したところ、騒音群で認めたCochlear synaptopathyが治療では改善する傾向を認めた。
また、ZoledoranateはMevalonate PathwayのPyrophosphate Synthase (FPPS)と競合拮抗しFPP、GGPPの合成を低下させ神経軸索延長やシナプス形成に重症な細胞シグナル伝達に関わるタンパク質のプレニル化を阻害する。蝸牛におけるZoledornateの作用機序を明らかにするため、コルチ器におけるFPPSの発現を免疫組織染色にて蝸牛神経細胞に発現していることを確認し、騒音暴露前後での発現の変化を検討した。さらに、蝸牛軟部組織を採取しFPPSの発現をリアルタイムPCR、ウエスタンブロッティングにて検討した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
Zoledronateの騒音性難聴に対する治療効果を検討するため、聴覚検査により難聴を生理学的に評価した。7週CBA/CaJマウスに97dBSPL・2時間の騒音を暴露し、 騒音性難聴マウスを作製し、騒音暴露24、48、72時間後にZoledronateもしくは同量のsalineを皮下投与し、暴露前・後、治療2週間後に、DPOAE、ABRにて聴力を評価した。聴覚閾値、I波の振幅を評価したところ、聴覚閾値に明らかな変化は認めなかったが、治療群において22.65kHz、32kHzのI波の振幅が有意に改善した（n=9）。また、組織学的解析のため、蝸牛を採取しwhole mountを作成し、抗Myo7a抗体（内有毛細胞の指標）、抗CtBP2 (C-terminal Binding Protein) 抗体（前シナプスの指標）、抗GluA2 (Glutamate receptor subunit A2) 抗体（後シナプスの指標）を用い免疫染色を行い共焦点顕微鏡で観察し、内有毛細胞辺りのpaired synapse ribbon数を定量的に評価したところ、治療群ではpaired synapse ribbonが保持され、Cochlear Synaptopathyへの治療効果が示唆された（n=3）。
ZoledronateはMevalonate PathwayのFPPSと競合拮抗し、神経新生に重要なタンパク質のプレニル化を阻害する。蝸牛における薬物作用機序を解析するため、コルチ器におけるFPPSの発現を免疫組織染色にて解析したところ、蝸牛神経細胞に発現していることを確認した。リアルタイムPCRにてFPPSのmRNAの定量的評価し治療群・非治療群とで比較検討している。また、FPPS蛋白発現をウエスタンブロッティングにより評価を試み、抗体の最適化を検討中である。
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| 今後の研究の推進方策 |
Cochlea Synaptopathyを組織学的に検討しZoledoranate治療効果を統計学的に検討する。騒音暴露2週間後に蝸牛を採取してWhole mountを作成して免疫組織染色を行い、共焦点顕微鏡で観察し、内有毛細胞の基底外側部分の前・後シナプス数を測定し、シナプスリボン数を定量評価し、治療群と非治療群とで比較しZoledoranateによるによるCochlea Synaptopathyの治療効果を検討しているが、今後、統計学的解析するため動物数を重ねていく必要がある。
コルチ器におけるFPPSやFPPS作用点下流の生成物（Farnesyl Pyrophosphate: FPP、Geranyl-geranyl Pyrophosphate: GGPP）の騒音暴露前後やZoledronate治療介入前後の発現の変化をリアルタイムPCR、ウェスタンブロッティングを用いて検討中であるが、今後も動物数を重ねていく必要がある。また、リアルタイムPCR、ウェスタンブロッティング等で評価が不十分な場合はHPLCを用いた評価も検討する必要がある。
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